Découverte et optimisation de 2-Aryl Benzimidazole puissant, sélectif et in vivo efficace BCATm Inhibitors

Études récentes

suggérer ramifié

les aminotransférases à chaîne (BCAT) en tant que cible potentielle

troubles. Les BCAT catalysent la transamination des acides aminés à chaîne ramifiée

(BCAA) leucine, isoleucine et valine à leur α -keto

les acides, qui sont ensuite convertis en succinyl-CoA et en acétyl-CoA

et participent au cycle de l’acide tricarboxylique et à la glycolyse.1 Il y a deux isozymes, mitochondrial (BCATm)

et cytosoliques (BCATc), et les isozymes BCAT humaines sont identiques à 58%

séquence d’acides aminés.2 Bien que le BCATm soit

exprimé dans de nombreux tissus périphériques, le BCATc est largement restreint

au système nerveux central.1 Un récent

étude de knockout de BCATm de souris a démontré que le manque de cette enzyme a augmenté

la dépense énergétique de la souris, associée à une protéine futile

cycle de rotation, et les a protégés de l’obésité quand soumis à

régime alimentaire riche en graisses3. Valider davantage le BCATm

comme cible thérapeutique pour l’intervention des troubles métaboliques,

un petit inhibiteur moléculaire approprié avec activité, sélectivité et activité in vivo est hautement souhaitable. Pour développer de tels inhibiteurs,

nous avons utilisé diverses technologies de dépistage, y compris HTS, à base de fragments

écran, et ADN Encoded Library Technology (ELT) .4 − 6 Ici, nous signalons

la découverte d’une nouvelle série à succès BCATm d’ELT7 − 12 et de structures subséquentes –

finalement conduit à la découverte d’un non seulement très puissant mais aussi

composé hautement sélectif et efficace in vivo

(8b) qui a augmenté les taux sériques de BCAAs après l’administration orale

À la poursuite de nouveaux inhibiteurs de petites molécules de BCATm,

nous avons examiné

la construction de protéine BCATm humaine chimiquement biotinylée contre

nos plus de 14 milliards de composés codés par l’ADN.13 Plusieurs séries à succès ont été identifiées et l’une d’elles

à partir d’une nouvelle bibliothèque à base de benzimidazole à trois cycles qui contient

117 millions de composés distincts. Comme montré dans le schéma 1, la bibliothèque a utilisé 65 diamines monoprotégées

au cycle 1, formé le cycle benzimidazole avec 922 aldéhydes au cycle

2, puis la déprotection des amines a été réagie avec le bâtiment de 1960

blocs au cycle 3 pour fournir la bibliothèque finale de 117 millions de composés.

Sélection des diamines, des aldéhydes et du cycle 3

les blocs étaient basés sur la disponibilité, les propriétés de type médicament et la réactivité.

Les détails de la synthèse de la bibliothèque feront l’objet d’un

publication dans un proche avenir.Schéma 1Structure de l’ADN codé benzimidazole

BibliothèqueLa projection de cette

la bibliothèque a suggéré deux sous-plateaux préférés

I et II pour BCATm comme illustré par une vue de cube Spotfire dans la figure ​ Le plus prometteur

BCATm succès de ce criblage de la bibliothèque est illustré par le composé 1 (I, R2 = 2- (méthylthio) phényle, figure ​ Figure 11, également dans le schéma 2) qui présentait l’inhibition de BCATm humaine.

dans les dosages biochimiques et cellulaires (pIC50, 6.6 et

6,8, respectivement) avec une sélectivité d’environ 5 fois sur BCATc (pIC50, 5,9). L’étude pharmacocinétique chez la souris (PK) a suggéré que 1 a une demi-vie courte de 1,4 h et une faible biodisponibilité orale

(dix%). Pour améliorer la puissance et les propriétés PK, nous avons réalisé des études SAR

environ trois moitiés différentes de cet échafaudage à base de benzimidazole

y compris la position 2 du benzimidazole (R2), la fraction bromothiophène,

et la position 5 du benzimidazole où l’ADN était fixé à l’origine.

Puisque le sous-platier II est très similaire au sous-pli I, non

Des exemples ont été réalisés pour cette série. Figure 1: Résultat de l’écran BCATm de l’ADN codé

bibliothèque de benzimidazole

et les structures génériques des deux séries BCATm hit I et II, où

BB1, BB2 et BB3 désignent respectivement les blocs de construction des cycles 1, 2 et 3.

Les composés de la ligne 1 et de la ligne 2 ont en commun … Une synthèse représentative pour

les modifications proposées sont illustrées

dans le schéma 2. Brièvement,

remplacement fluoro du 4-fluoro-3-nitrobenzamide (2) par

1,3-cyclohexyldiamine suivie d’une réduction nitro in situ et simultanée

la cyclisation avec un aldéhyde dans des conditions de dithionite de sodium (Na2S2O4) a conduit au 2-aryl benzimidazole

intermédiaire (4) qui, après déprotection de Boc, était acylé

par un acide carboxylique approprié pour fournir le produit désiré 1 et ses analogues. La purification par HPLC a donné deux diastéréoisomères

(chacun est un mélange racémique de deux énantiomères) avec l’isomère cis

étant la configuration la plus active. Alternativement, le disynthon N- (3-aminocyclohexyl) -5-bromothiophène-2-carboxamide (6, cis-confirmation) a été synthétisé d’abord suivi par fluoro

remplacement du 4-fluoro-3-nitrobenzamide et cyclisation avec un

aldéhyde pour obtenir le composé désiré 1 et ses analogues.Tous les composés synthétisés ont été évalués pour l’inhibition du BCATm.

dans un test biochimique, et certains composés sélectionnés ont été testés

dans un test cellulaire.4,5 Les deux activités enzymatiques et cellulaires

sont résumés dans les tableaux 1 – 3.Scheme 2Synthesis of 1,2,5-Substituted

Benzimidazole AnaloguesTable 1Benzimidazole 2-Position SARWe a commencé notre structure

optimisation en adressant potentiellement

groupe 2- (méthylthio) phényle labile. Comme indiqué dans le tableau 1, à la position 2 benzimidazole, le remplacement

de ce groupe avec le phényle non substitué (8a) conduit à une augmentation

Activité inhibitrice du BCATm. Nous avons ensuite converti le groupe phényle

en 2-pyridinyle (8b), 3-pyridinyle (8d),

et 4-pyridinyl (8e) groupes dans un espoir de diminuer encore

lipophilicité tout en maintenant une activité adéquate. Le 2-pyridinyle

analogue a montré une activité similaire à l’analogue phényle dans les deux enzymatiques

et les dosages cellulaires, alors que les 3-pyridinyl et 4-pyridinyl

analogues ont montré une diminution de la puissance suggérant que les interactions polaires

dans cette région sont mal tolérés. Plusieurs hétéroaryl à cinq membres

des anneaux comprenant du thiophène, du thiazole et du pyrazole ont également été explorés.

Alors que les analogues de 2- ou 3-thiophène (8f, 8g) ont atteint une puissance similaire à celle de l’analogue phényle dans les deux

et les dosages cellulaires, les deux analogues de thiazole (8h, 8i) ont montré une activité modérément réduite. Similaire au 4-pyridinyle

analogue, le composé pyrazole (8j) avait beaucoup diminué

activité enzymatique, confirmant l’observation précoce que la polarité

n’est pas toléré ici. Il convient de mentionner que pour tous les

composés dans les tableaux 1 – 3 la 1,3-cyclohexyldiamine est

la configuration cis. Passage à la trans-configuration rendue

les composés sont presque inactifs.14 Tableau 2SAR pour la fraction de bromothiophèneNous avons ensuite exploré le SAR autour du 5-bromothiophène-2-carboxamide

fragment comprenant l’introduction de substituts bromo, le remplacement de l’anneau thiophène,

et des modifications de la liaison amide lieur. Deux séries de composés

avec du carboxamide (9A) ou du N-méthyl

carboxamide (9B) à la position 5 du benzimidazole

préparées simultanément à cet effet, comme indiqué dans le tableau 2. Dans la série 9A,

remplacement de cyano (9Aa) et de chloro (9Ab)

du groupe bromo conduit à une activité modérément diminuée dans les deux enzymatiques

et les activités cellulaires, et l’analogue de méthyle (9Ac) a produit > 10 fois diminution de l’activité mettant en évidence l’importance

du substituant bromo. De même, la N-méthylation

de la liaison amide (9Ad) ou la conversion en un sulfonamide

(9Ae) abolit significativement l’activité. Dans la série 9B, des anneaux hétéroaryliques supplémentaires en remplacement du thiophène

ont été explorés. La commutation de l’anneau thiophène en thiazole (9Ba) a entraîné une perte d’activité de près de 2 log. De même, le 5-bromo-N-méthyl pyrrol-2-yle (9Bb), le 4-bromo-pyrro-2yl

(9Bc) et analogues de 3-chloroisoxazol-5-yl (9Bd)

étaient tous beaucoup moins actifs que l’anneau de thiophène identifié à partir de

l’écran original de la bibliothèque. Table 3SAR at Benzimidazole

5-PositionLastly nous avons exploré l’effet de substitution à

la position 5 du benzimidazole

où le lieur d’ADN original a été attaché. Comme le montre le tableau 3, l’amide de méthyle (8b) et l’amide primaire (8c) ont une activité enzymatique similaire, mais la

une diminution significative de l’activité cellulaire. Enlèvement du carboxamide

fragment (10a) a conduit à plus de 1 perte de log de l’enzymatique

activité, et son activité cellulaire est indétectable. Convertir le

carboxamide en N, N-diméthylamide

(10b) a rendu le composé presque inactif. Un effort

pour assurer la substitution optimale à cette position a incité la synthèse

des analogues du cyclopropylamide (10c) et de l’isopropylamide (10d), mais aucun n’a dépassé l’activité de 8b. Par conséquent, le groupe méthylamide semble le meilleur choix pour

cette position.Nombreux composés avec puissant enzymatique et

activités cellulaires

ont progressé vers les études de sélectivité et de pharmacocinétique (PC) du BCATc.

Le composé 8b s’est avéré inhiber BCATc avec pIC50 = 5,4 (n = 2), ce qui est environ 100 fois

sélectif pour BCATm sur BCATc, une amélioration significative par rapport

à la frappe initiale, 1 (pIC50, BCATm / BCATc,

6,6 / 5,9). Pendant ce temps, 8b a également démontré une supériorité

Profil PK par rapport à 1, comme indiqué dans le tableau 4. Le composé 8b a

diminution de la clairance (4,0 mL / min / kg vs 23 mL / min / kg) et

une biodisponibilité orale accrue (28% contre 10%) et une diminution des protéines plasmatiques

liaison (97,1% contre 99,5%). En conséquence, un temps T1 / 2 plus long et une exposition beaucoup plus élevée et une Cmax ont été atteintes par 8b. Le composé 8b s’est révélé en outre inhiber le BCATm de souris avec pIC50 =

5,9 (n = 4) dans le test cellulaire. Par conséquent, 8b a été sélectionné comme candidat pour des études in vivo visant à étudier la pharmacologie de l’inhibition du BCATm.

chez les souris.Une structure cristalline à rayons X à haute résolution (2.0 Å)

de BCATm

dans un complexe avec le composé 8b a été obtenu comme représenté sur la figure ​ Dans cette structure,

le composé 8b se lie au site actif du BCATm proximal

au cofacteur de pyridoxal-5 ′ -phosphate (PLP), qui est covalent

lié à Lys202 (Figure ​ Figure 22a). Le ligand adopte une conformation en forme de T dirigeant le

2-pyridyle vers le PLP, tandis que l’anneau de benzimidazole lui-même

parfaitement pris en sandwich entre Phe30 et Ala314 formant une grande aromatique

les contacts avec les deux (Figure ​ Figure 22b). L’amide de méthyle à la position 5 de benzimidazole fait

H-liaisons de son carbonyle à l’azote basique de Lys79 et à l’eau

de son groupe NH (Figure ​ Figure 22c). Augmentation de la taille du substituant amide du méthyle

en cyclopropyle (10c) ou isopropyle (10d)

diminue l’affinité due à l’espace restreint à cette position. Le groupe cis-1,3-diaminocyclohexyle à la position 1 du benzimidazole

dirige l’anneau 5-bromo-thiophène profondément dans une poche hydrophobe

formé par Met241, Gln224, Val182 et Cys318 (figure ​ figure 22a). Le linker amide ancre cette

trajectoire en formant une liaison H entre son oxygène carbonyle et le

colonne vertébrale NH de Thr240, et une interaction pontée par l’eau entre le

l’amide NH et le Tyr173OH. L’atome de soufre thiophène se trouve sur le côté

de l’anneau à côté de l’oxygène de l’amide. Échanger le brome sur le

thiophène pour le groupe de chlore (9Ab) ou de méthyle (9Ac) entraîne une activité réduite, ainsi le brome fournit le

meilleur contact lipophile avec la poche hautement hydrophobe.Figure 2Vue de la structure cristalline aux rayons X de BCATm

dans le complexe avec 8b (en cyan) et cofactor PLP (en jaune) .Une comparaison des modes de liaison entre 8b et récemment

publié ELT série 11 (composé 15e dans

ref (4), code PDP 5CR5) ainsi que le

HTS série 12 (composé 66 dans la référence (5), code PDP 5BWX) a révélé que

deux séries ELT se lient à BCATm dans une orientation similaire, alors qu’ils

chevauchent seulement partiellement la série HTS (Figure ​ Figure 33). Les interactions clés dans 8b incluant les contacts aromatiques étendus avec Phe30 et Ala314

(Figure ​ Figure22b) et hydrogène

des interactions de liaison avec les deux Lys79 et une eau (figure ​ figure22c) manquent dans 11 et 12, ce qui pourrait expliquer la puissance réduite de 11 et le manque de sélectivité de 12. La cristallographie

L’analyse confirme également le résultat du travail SAR et suggère que

les exigences pour une bonne liaison ont été bien remplies par la structure

diversité de la bibliothèque de benzimidazole.Figure 3Overlay des structures de rayons X des données 8b, 11 et 12.Table 4PK

pour les composés représentatifsPour tester si le composé 8b peut augmenter la

niveau

des acides aminés à chaîne ramifiée circulants, les souris ont été donnés soit

le composé à 300 mg / kg de P.O. ou véhicule après 5 h de jeûne. Après

30 min, les souris ont été refaites avec un mélange d’acides aminés (1,5 g / kg / 10 ml,

P.O.) suivi d’un prélèvement sanguin et tissulaire à 1 heure après le

quantifier les niveaux d’acides aminés. Comme le montre la figure ​ Figure44, les niveaux élevés de Leu, Ile et Val étaient

observé dans le plasma. Encouragé par cette observation, nous avons encore testé

le composé pour son effet sur les BCAA ’ le métabolisme pendant une période prolongée

période de temps. Comme le montre la figure ​ Figure55, le composé a été administré à différentes doses (30, 100,

et 300 mg / kg, P.O.), et le mélange d’acides aminés a été alimenté après 6 h de

dosage de médicament. Cette étude a confirmé les résultats initiaux et démontré

augmentation dose-dépendante des trois niveaux de BCAA par rapport à la sérine

et les commandes du véhicule. Ces expériences ont démontré que le BCATm

l’inhibiteur 8b a effectivement augmenté les niveaux de BCA

un modèle animal aigu sur une durée prolongée. Figure 4: Dosage aigu de 8b à 300 mg / kg suivi d’une réalimentation

les souris avec un mélange d’acides aminés après 30 min: quantification des BCAAs

niveau de sérum à 1 h après l’allaitement.Figure 5Dose aiguë de 8b à 30, 100 et 300 mg / kg P.O.

suivi d’une réalimentation du mélange d’acides aminés après 6 h: quantification

de niveau de sérum BCAA à 1 h post-alimentation. En résumé, le dépistage d’affinité d’un 117 millions d’ADN codé

Bibliothèque

identifié une nouvelle série de succès BCATm à base de benzimidazole, qui était

suivi d’une vaste étude SAR qui a mené à la découverte du composé 8b, un inhibiteur puissant et sélectif du

Propriétés PK La structure cristalline aux rayons X de BCATm dans un complexe avec 8b a révélé que le composé se lie à BCATm à un site qui

est proche du résidu catalytique lysine 202 et du cofacteur PLP

site de liaison. Finalement, le composé 8b a démontré

l’efficacité dans un modèle PD de la souris, où il a réussi à élever les niveaux

des trois BCAA. Le composé 8b est donc un précieux produit pharmacologique

outil pour étudier les rôles biologiques de BCATm dans le métabolisme

maladies