La mutagenèse chimique systématique identifie un nouvel hybride efficace d’apratoxine A / E avec l’activité antitumorale in vivo améliorée

Les cellules cancéreuses sont caractérisées par une signalisation pro-croissance aberrante, habituellement induite par la liaison de ligand à leurs récepteurs tyrosine kinases (RTKs) correspondants, Par conséquent, les RTK sont devenues des cibles thérapeutiques majeures qui ont entraîné le développement de petites molécules spécifiques (p. ex. l’erlotinib) et d’anticorps (cétuximab et panitumumab) ciblant les récepteurs du facteur de croissance épidermique2. l’utilisation d’inhibiteurs de la RTK à spectre plus large (sorafenib et sunitinib), ciblant le récepteur du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR), peut être plus avantageux .3 − 5 Alternativement, les ligands eux-mêmes peuvent être ciblés, ce qui a conduit au développement et à l’approbation par la FDA d’un anticorps anti-VEGF-A (bevaci zumab) pour le traitement du cancer colorectal.6,7 En étudiant le mécanisme d’action du produit naturel marin apratoxine A (Figure 11), 8 appartenant à une classe de cytotoxines puissantes produites par des cyanobactéries marines, 9 − 12, nous avons soulevé la possibilité que l’inhibition de la voie sécrétoire au niveau de la translocation cotranslationnelle par les apratoxines et, en général, pourrait être exploitée pour le traitement anticancéreux.13 L’inhibition de ce processus empêche l’exportation de récepteurs et de molécules sécrétoires du cytoplasme appauvrissement des récepteurs (y compris RTK) et devrait en outre empêcher la sécrétion des ligands, des facteurs de croissance et des cytokines correspondants.14 Ce perforateur devrait avoir une activité antiproliférative exceptionnellement puissante et peut être une alternative efficace à la polythérapie à ou à large spectre) RTK et inhibiteurs de facteurs de croissance et peut être particulièrement utile pour traiter les cancers où les boucles autocrines, c’est-à-dire prolifèrent de manière non contrôlée. Ici, nous testons cette hypothèse par une combinaison de chimie médicinale basée sur l’échafaudage de l’apratoxine, la pharmacologie moléculaire in vitro et in vivo, et l’efficacité des xénogreffes tumorales colorectales. Études 1: Les apratoxines connues et les cibles synthétiques 1a obtenues par incorporation d’alanine ou de valine dans l’apratoxine A à différentes positions (apratoxines F et S1 – S3) ou par “ ” des apratoxines A et E (apratoxine … Puisque nous avons constaté que l’activité de l’apratoxine A était réversible, 13 il est devenu évident que les apratoxines doivent être administrées selon un schéma chronique à faible dose plutôt que sous forme d’injection en bolus. Nos données préliminaires sur l’administration chronique de l’apratoxine A (Figure S3 dans les Informations complémentaires), récemment confirmées par d’autres, 12 indiquent que ce composé présente une certaine efficacité antitumorale in vivo mais n’est pas bien toléré. La fenêtre thérapeutique est petite, nous avons trouvé un taux de mortalité de 50% (jour 16) à la concentration thérapeutique de 0,25 mg / kg (ip quotidienne) avec une toxicité irréversible survenant après 2 semaines de traitement (Figure S3 en La principale question restait posée de savoir si cette toxicité était liée à un mécanisme ou à un effet non ciblé.Nous décrivons ici la synthèse et l’évaluation biologique d’analogues synthétiques de l’apratoxine dont la puissance et l’efficacité sont supérieures à celles du composé d’origine et mieux tolérée in vivo, ce qui constitue un fondement pour les apratoxines de deuxième génération avec un potentiel anticancéreux plus prometteur et valide ce nouveau mécanisme d’action pour le traitement du cancer.Notre objectif était triple: Nous avons cherché (1) à définir des éléments critiques et accordables pour l’inhibition de la translocation co-traductionnelle, (2) étendre nos précédentes études sur les récepteurs et prouver que le transport des récepteurs et leurs ligands correspondants sont inhibés par les apratoxines et (3) avec une puissance améliorée et des effets secondaires moins toxiques in vivo. Après le rapport de la première synthèse totale, 16 études de structure et de relation d’activité (SAR) par d’autres groupes se sont concentrées sur la chaîne polycétide (C33 – C43) 17,18. La cytotoxicité de l’Apratoxine est hautement sensible à certaines modifications structurelles. cette unité. L’inversion de la configuration à 37 ° C de 37S à 37R ou l’élimination du groupe méthyle en C37 ont aboli l’activité antiproliférative des apratoxines, indiquée pour l’analogue de l’oxazoline17, mais l’épimère C-34 de l’apratoxine A a montré une activité équipotente18. la lignée cellulaire, le produit de déshydratation C35 de l’apratoxine A possédait une cytotoxicité réduite de 29 fois.11 Cependant, la puissance de l’apratoxine E (Figure 1) (Figure 1), tout en étant également insaturée en C34 et C35, est seulement 6 fois moins cytotoxique que l’apratoxine A, ce qui suggère que modification dans l’unité moCys (C27 – C31), à savoir. l’élimination du groupe méthyle et / ou l’insaturation peuvent augmenter l’activité si la configuration initiale hydratée de C34 et de l’apratoxine A peut être rétablie. Nous avons également émis l’hypothèse que le système α, β -unsaturated dans l’unité moCys peut être responsable de la toxicité non spécifique (hors cible) en raison de l’addition conjuguée de nucléophiles cellulaires. Ainsi, nous avons cherché à synthétiser un tel hybride A / E d’apratoxine (1e) avec, espérons-le, une activité anticancéreuse améliorée et également une sélectivité tumorale. En outre, nous avons interrogé les modifications dans la partie peptidique, où il est connu que l’absence de N-méthylation de l’isoleucine réduit l’activité (apratoxine B) 9 et le remplacement de la proline par la N-méthyl alanine retient largement l’activité (1a, apratoxine F) ​ (Figure1) .1). Nous avons effectué un balayage d’alanine (sans changer le modèle de N-alkylation) et synthétisé un analogue de valine pour sonder plus largement les exigences d’hydrophobicité de la position R3 (Ile → Val → Ala; Figure ​ Figure1 ), 1), qui a conduit à la première synthèse du produit naturel apratoxine F (1a) et des congénères positionnels (1b – d), fournissant un nouvel aperçu de la SAR des apratoxines.Scheme 1 illustre les principales procédures de synthèse pour obtenir le analogues de l’apratoxine désirés, étroitement en parallèle des stratégies de synthèse rapportées et de l’analyse rétrosynthétique pour l’apratoxine A avec des modifications mineures.19,20 L’aldéhyde 2 (19 𳳴 21) a été traité avec le (E) -crotylboronate de Roush 3 (22) pour le groupe hydroxyle avec Troc a donné 5, et l’élimination du groupe PMB avec DDQ, suivie d’une estérification avec Fmoc-Pro-OH / Fmoc-N-Me-Ala-OH en utilisant la méthode Yamaguchi, 23 a fourni l’ester 6. L’acide 7 a été obtenu 6 a été oxydé avec le système d’oxydation OsO4 / oxone / NaIO4. f 6 avec cystéine modifiée amine 8 a donné les intermédiaires clés 9. En utilisant la méthode Kelly (PPh3 (O) / Tf2O dans CH2C12), 17,19,20,25 le cycle thiazoline a été formé, et Troc a été retiré immédiatement après. L’élimination subséquente d’allyle à partir de 10 avec du Pd (PPh3) 4 / N-méthylaniline a fourni l’acide 11, qui a été couplé avec le tripeptide 12 (voir les Informations de Support) en utilisant HATU / DIEA pour donner des composés linéaires protégés. Clivage de l’ester O-allylique par Le Pd (PPh3) 4 / N-méthylaniline et l’élimination de Fmoc par Et2NH / MeCN ont donné des précurseurs de cyclisation, dont la macrolactamisation finale avec HATU / DIEA sous une concentration de dilution élevée a fourni des apratoxines la et un rendement de 52%. Nous avons utilisé la même stratégie pour synthétiser l’apratoxine A pour une comparaison directe dans nos dosages biologiques.Schéma 1 La préparation des analogues de l’apratoxine AWe a montré que l’apratoxine F (1a) était l’analogue de l’apratoxine A le plus puissant issu d’un balayage alanine; les deux composés ont montré des effets comparables sur la viabilité des cellules de carcinome colorectal HCT116 (Tableau 1) et sur les niveaux de récepteurs proto-oncogènes (MET) rencontrés (Figure 2a) .2a). En revanche, les deux autres alanine scan “ mutants ” Lb et ld présentaient une activité fortement réduite dans les deux dosages. Le remplacement de Ile avec Val (1c) n’a pas affecté l’activité. Cependant, l’apratoxine S4 (1e) — l’hybride A / E de l’apratoxine (figure ​ (figure1) — was1) — était supérieur par rapport à toutes les autres apratoxines (figure ​ (Figure2a, b2a, b et Tableau 1), cohérent avec notre hypothèse.Aussi suite à l’échelle de synthèse, nous avons identifié deux produits de réaction mineurs que nous avons caractérisés comme 2-epi-1e et 34-epi-1e (Figure # x200B; (Figure 11 et voir les informations de support), que nous avons inclus dans nos études SAR, alors que les 2-épi-1e ont perdu environ 200 fois leur activité, les deux 34-épimères de 1e étaient presque également actifs. , la viabilité cellulaire (Tableau 1) est bien corrélée avec la réduction des niveaux de récepteurs basée sur l’analyse immunoblot (Figure 2a), 2a), suggérant que la configuration en C-2 est cruciale pour une cytotoxicité puissante, alors que le C- La configuration de 34 n’est pas pertinente comme cela a été récemment trouvé pour l’apratoxine A.18 Figure 2 Activité cellulaire des apratoxines (cellules HCT116) (a) SAR par analyse immunoblot pour les niveaux de RTK (MET) après 24 h. paraison des effets de l’apratoxine A et S4 (1e) sur (b) la viabilité cellulaire (48 h, n = 4) et (c) la sécrétion de VEGF-A (12 h, n = 3). Les barres d’erreur indiquent … Tableau 1Activités des Apratoxines sur la viabilité des cellules HCT116 et la sécrétion de VEGF-ANext, nous avons étendu nos études SAR à nos effets hypothétiques des apratoxines sur la sécrétion du facteur de croissance et focalisé sur la cible du médicament angiogénique VEGF-A.En effet, toutes les apratoxines ont inhibé la sécrétion du VEGF-A (Tableau 1 et Figure 2c), confirmant ainsi notre hypothèse que les apratoxines empêchent l’exportation des récepteurs et la sécrétion des ligands, ce qui est également En outre, en fonction de la structure de l’apratoxine, les valeurs de CI50 étaient 20 fois plus faibles que les valeurs de CI50 pour la viabilité cellulaire, ce qui suggère que le VEGF-A est plus sensible à l’inhibition. de la sécrétion par rapport aux protéines réceptrices testées. Cela indique que la réduction des niveaux de VEGF-A (et probablement d’autres ligands) seul n’est pas suffisante pour inhiber la prolifération et que l’épuisement des récepteurs est une nécessité. Ce résultat soulève également la possibilité que la sélectivité du substrat des apratoxines vis-à-vis de l’inhibition de la sécrétion puisse être ajustée par des modifications structurelles, qui font l’objet de recherches continues dans notre laboratoire. Nous avons ensuite testé notre composé prioritaire (1e) sur le cycle cellulaire. Déterminer si ses effets sont parallèles à ceux de l’apratoxine A. En accord avec les données de l’apratoxine A, 29 l’analyse du contenu en ADN dose-dépendante des cellules HCT116 après 24 h de traitement a révélé que 1e augmente la population de cellules en phase G1 concomitante à la diminution des phase, à partir de concentrations subnanomolaires (0,32 nM) avec l’effet le plus fort à 3,2 nM (Figure 2d), qui est la gamme de concentration pour l’inhibition des niveaux de VEGF-A et de récepteur et également près de la CI50 pour viabilité cellulaire (tableau 1). Ensuite, nous avons confirmé que l’inhibition de la voie sécrétoire par l’apratoxine S4 (1e) se produit au niveau de la translocation cotranslationnelle du cytoplasme vers le réticulum endoplasmique.13 Nous avons utilisé des expériences de traduction in vitro en présence de membranes microsomiques pour démontrer l’inhibition par 1e d’événements de traitement cotranslationnels caractéristiques de molécules sécrétoires, en particulier la glycosylation (en utilisant le substrat de l’ARNm du facteur &#x003b1) et le clivage du peptide signal (en utilisant le substrat de l’ARNm de & lt; x003b2; -lactamase). L’inhibition du traitement cotranslational d’une manière dose-dépendante est cohérente avec le mode d’action que nous avions signalé pour l’apratoxine A (Figure 33) (Figure 33) .13 Nous avons également utilisé un ADNc de récepteur humain (PDGFR – β) et prouvé par couplage in vitro transcription / traduction que 1e inhibe le traitement de cette RTK associée au cancer (figure 33) .La figure 3Apratoxin S4 (1e) inhibe le traitement cotranslational in vitro Produits de réactions de traduction in vitro (reticulocyte de lapin , acides aminés, [35S] méthionine, membranes microsomiques pancréatiques canines, matrice ARNm, et apratoxine 1e) ont été séparés par SDS-PAGE … Des études initiales in vivo visant à déterminer la dose maximale tolérée (MTD) ont déjà suggéré que 1e est beaucoup mieux tolérée in vivo que l’apratoxine A, ce qui est cohérent avec notre hypothèse selon laquelle le système conjugué pourrait être une responsabilité in vivo, alors que de fortes doses (0,375 mg / kg) d’apratoxine A entraînent une toxicité irréversible, c’est-à-dire poids l osseuse et la mort éventuelle même lorsque l’injection ip a été interrompue, les souris traitées avec l’apratoxine S4 (1e) se sont rapidement rétablies lorsque les injections à forte dose ont été arrêtées. En utilisant la même faible dose de 0,25 mg / kg de 1e (ip quotidienne pendant plus de 2 semaines) utilisée pour l’apratoxine A pour traiter les souris nu-nu HCT116 (Figure S3 dans l’Information de Support), l’effet antitumoral était beaucoup plus fort ( Figure ​ (Figure4a) 4a) sans toxicité évidente basée sur l’absence de perte de poids et l’évaluation histologique des tissus rénaux et hépatiques. Pour déterminer si le mécanisme d’action in vivo est en corrélation avec nos données in vitro, nous avons mesuré les niveaux de récepteurs dans le minuscule tissu tumoral résiduel et constaté que VEGFR2 et PDGFR – β les niveaux étaient épuisés (figure ​ (figure4b) .4b). En revanche, le foie semble moins affecté, car nous n’avons pas observé une réduction significative de VEGFR2 dans ce tissu des mêmes souris (Figure 4c), ce qui peut indiquer une absorption préférentielle de 1e par la tumeur et / ou une dépendance accrue de la tumeur sur la voie de sécrétion en raison du renouvellement plus rapide et de la resynthèse des molécules réceptrices. Figure 4 Activité in vivo de l’apratoxine S4 (1e) en utilisant un modèle de souris xénogreffe HCT116. (a) Études d’efficacité (ip quotidienne). Des souris portant des tumeurs sous-cutanées ont été injectées avec le véhicule 1e (n = 8) ou le véhicule DMSO (n = 10), et les volumes tumoraux ont été surveillés au cours du temps. Barres d’erreur … En conclusion, l’apratoxine S4 (1e) est le premier candidat viable de la famille des apratoxines qui montre la sélectivité tumorale requise et l’augmentation de l’activité antitumorale et de la puissance. Ainsi, nous avons largement séparé l’activité anticancéreuse de la toxicité non sélective, indiquant pour la première fois que l’inhibition de la translocation cotranslationnelle est un nouveau mécanisme prometteur pour le traitement du cancer, notamment pour traiter les cancers caractérisés par des boucles autocrines aberrantes comme le cancer colorectal.De plus, nos études SAR suggèrent que grâce à une modification structurelle, nous pouvons ajuster la sélectivité de l’apratoxine sur certains substrats destinés à la voie sécrétoire, ce qui pourrait être exploité pour fournir une thérapie adaptée et des outils chimiques plus sélectifs pour étudier la voie sécrétoire. none