Le polymorphisme précoce de l’arrêt chez les humains DECTIN- est associé à une augmentation de la colonisation par les Candida chez les receveurs de greffe de cellules souches hématopoïétiques

Contexte Traitement intensif des malignités hématologiques par greffe de cellules souches hématopoïétiques La HSCT s’accompagne d’une forte incidence d’infection fongique invasive opportuniste, mais le risque individuel varie de manière significative Dectine – une lectine de type C qui reconnaît les -β-glucanes des pathogènes fongiques, y compris Candida espèce, est impliquée dans l’initiation de la réponse immunitaire contre fungiMethods Le dépistage du polymorphisme DECTIN-YX au sein d’un groupe de patients subissant HSCT a été corrélé avec la colonisation Candida et la candidémie En outre, des études fonctionnelles ont été réalisées sur les conséquences du polymorphisme. le polymorphisme du gène DECTIN- était plus susceptible d’être colonisé par les espèces Candida, comparativement aux patients porteurs de DECTIN de type sauvage, nécessitant une utilisation plus fréquente du fluconazole dans la prévention de l’infection systémique à Candida. Les tests fonctionnels ont démontré un phénotype de perte de fonction. le polymorphisme, comme le montre le d Le polymorphisme YX est associé à une augmentation de la colonisation orale et gastro-intestinale avec les espèces Candida. Cela suggère un rôle crucial de la dectine dans les mécanismes antifongiques des muqueuses des hôtes immunocompromis. La découverte que les polymorphismes DECTIN ont rendu les receveurs le risque accru de complications fongiques peut contribuer à la sélection de patients à risque élevé qui devraient être considérés pour une prophylaxie antifongique afin de prévenir la candidose systémique

Le traitement des patients atteints de tumeurs malignes hématologiques avec greffe de cellules souches hématopoïétiques HSCT suite à un conditionnement myéloablatif s’accompagne de complications qui incluent une lésion de la barrière muqueuse, une neutropénie prolongée et une maladie du greffon contre l’hôte GvHD, qui contribuent aux infections fongiques et autres infections opportunistes [ ,] Les facteurs de risque traditionnels sont prédictifs de l’incidence de la maladie fongique invasive en général, mais le risque individuel est plus difficile à déterminer, bien que cela soit nécessaire pour une utilisation plus guidée de la prophylaxie antifongique et de la thérapie. famille de récepteurs qui reconnaît le motif β -, – glucane de la paroi cellulaire des champignons pathogènes Dectine – est principalement exprimée par les cellules immunitaires de la lignée myéloïde neutrophiles, macrophages et cellules dendritiques Plusieurs études ont montré que la dectine appartient à l’arsenal des cellules immunitaires contre les pathogènes fongiques, y compris les espèces de Candida et les espèces d’Aspergillus Furth ermore, dectine – synergise avec les signaux TLR et TLR et favorise les réponses Th et Th pour activer la défense antifongique de l’hôte Récemment, nous avons démontré qu’un polymorphisme de DECTIN-YX est responsable d’infections fongiques mucocutanées récurrentes dans une famille hollandaise non publiée. Ce polymorphisme aboutit à un codon stop précoce, qui conduit à la perte des derniers acides aminés du domaine extracellulaire, et à une diminution de la capacité à se lier aux β-glucanesPour tester l’hypothèse selon laquelle les variants DECTIN influencent la susceptibilité aux infections fongiques en général Nous avons d’abord évalué la fréquence des polymorphismes DECTIN dans une population néerlandaise en bonne santé. Nous avons identifié la mutation YX comme un polymorphisme important et la seule ayant des conséquences fonctionnelles significatives pour la reconnaissance des espèces de Candida. ont étudié l’impact de ce polymorphisme DECTIN sur l’incidence de la colonisation de Candida mucosale d la survenue d’une candidémie et d’autres infections fongiques invasives chez des patients ayant reçu une greffe allogénique allogénique de cellules germinales appauvries en cellules T

Patients, matériaux et méthodes

Dépistage génétique des polymorphismes -DECTINE Le modèle d’ADN du gène DECTIN- également nommé CLECA a été prélevé sur GenBank, position chromosomique p, NC_ Le séquençage des régions exoniques et introniques voisines du gène DECTIN- dans les volontaires sains a été réalisé en appliquant les amorces et conditions décrites dans le tableau Le génotypage de la présence du polymorphisme YX dans les groupes de patients et de donneurs a été réalisé en appliquant le test SNP du polymorphisme monoquotidique TaqMan C__ sur le système de réaction en chaîne par polymérase ABI Real-Time Applied Biosystems Patients, donneurs et volontaires sains avait donné son consentement éclairé à la collecte prospective d’échantillons d’ADN à des fins expérimentales

Table View largeTélécharger slidePrimers et conditions de réaction en chaîne de la polymérase appliquées à l’amplification de toutes les régions introniques exon et proximales du gène DECTIN- pour effectuer une analyse de séquence ViewTéléchargement de grande taillePrimères et conditions de réaction en chaîne de polymérase appliquées pour amplifier toutes les régions introniques exon et proximales du gène DECTIN- Effectuer une analyse de la cytométrie de flux Pour la coloration de la dectine membranaire, les monocytes ont été incubés avec μg / mL d’anti-dectine murine dirigée vers la région de tige BD conjuguée à la biotine, ou IgGb de souris immunoglobuline, suivie de chèvre conjuguée streptavidine-allophycocyanine. anticorps anti-souris Pharmingen Dectine expression a été déterminée par cytométrie de flux FACScalibur; BD Biosciences Microscopie confocale La microscopie confocale à balayage laser a été réalisée comme décrit par Meyer-Wentrup et coll. Les cellules ont été colorées avec μg / mL de clone anti-dectine de souris; Des systèmes R ou un contrôle d’isotype IgGb de souris, suivis d’anticorps secondaires de chèvre anti-souris-Alexa conjugué à Molecular Probes Samples ont été montés dans mowiol et analysés par microscopie confocale à balayage laser. Tests de stimulation Olympus FVCytokine L’isolement des cellules mononucléaires a été effectué comme décrit précédemment [ Les cellules ont été incubées à ° C pendant la durée indiquée h ou h avec le milieu de culture ou les divers stimuli: Candida albicans tués par la chaleur par incubation à ° C pendant min, l’agoniste TLR PamCys μg / mL et le β-glucane μg / mL ou une combinaison de PamCys et de β-glucane Dans une partie des expériences, après isolation des cellules mononucléaires des cellules mononucléaires du sang périphérique, les monocytes ont été purifiés par CDMACS MicroBeads Miltenyi Biotec et stimulés comme décrit précédemment. La production de cytokine a été mesurée par dosage immuno-enzymatique Systèmes R & D Patients et donneurs Nous avons réalisé une analyse rétrospective chez des patients hollandais subissant une TCSH à cause de malignité hématologique Les patients et les donneurs ont été admis consécutivement dans notre unité de transplantation de mai à septembre pour un HSCT allogénique allogénique à cellules germinales identique à l’antigène des leucocytes, partiellement allogénique. Les caractéristiques des patients, des donneurs et des procédures HSCT sont données dans le tableau

Tableau View largeTélécharger la lameCaractéristiques cliniques du groupe d’étudeTable Voir grandDownload slideClinical characteristics of the StudyGroupeTraitement du protocole Le protocole de traitement a été décrit en détail ailleurs Le schéma de conditionnement a consisté en cyclophosphamide mg / kg pendant des jours en combinaison avec l’irradiation corporelle totale Gy ou busulfan mg / kg pendant des jours Idarubicin mg / kg en h a souvent été ajouté à ce régime de conditionnement pour réduire le risque de rechute dans le cadre de HSCT appauvri en cellules T Le jour, tous les patients ont reçu une HSCT allogénique contenant × CDcells / kg de CDcells / kg de CDcells / kg, – CDcells / kgLa prophylaxie antimicrobienne consistait en mg de ciprofloxacine administrée deux fois par jour et en mg de valaciclovir administrés quotidiennement. Des cultures de surveillance ont été recueillies deux fois par semaine de l’admission à l’hôpital jusqu’à la sortie de l’hôpital, avec les premiers échantillons de culture obtenus le jour de l’admission à l’hôpital, avant le début de Le fluconazole mg par jour a été prescrit uniquement aux personnes qui ont été colonisées par C albicans, Candida tropicalis ou Candida parapsilosis et non par Candida krusei ou Candida glabrata lorsque la levure était présente dans les cultures fécales et les bains de bouche obtenus le même jour ou lorsque Le même site à plusieurs reprises Les infections fongiques invasives ont été définies conformément aux lignes directrices consensuelles de l’Organisation européenne pour le traitement du cancer / Mycoses, désignant la maladie fongique invasive comme possible, probable ou prouvée . le système de notation de la mucoviscidose Nijmegen validé NNMSS La GvHD aiguë a été diagnostiquée par des signes cliniques ou un examen pathologique d’échantillons de peau, de tube digestif ou de biopsie hépatique et a été classée selon les critères de Glucksberg et al Analyse statistique Dans des analyses de régression logistique multivariée, nous avons étudié l’association de la DECTIN- statut du patient avec Candida coloni Dans l’analyse de l’impact de la candidémie précoce, le statut DECTIN- des patients seuls, mais non des donneurs, a été considéré comme important. La candidémie précoce a été définie comme étant un jour ou plus tôt Dans la transplantation myéloablative de cellules souches, la récupération monocytaire survient habituellement seulement – semaines après la greffe , et par conséquent, la constitution génétique du donneur n’est pas considérée comme pertinente pour la susceptibilité à la candidémie précoce. – le statut du patient et la survenue d’une candidémie précoce ont été étudiés à l’aide de modèles de régression logistique tenant compte de l’âge du patient, de la maladie sous-jacente, de la durée de la neutropénie, de la présence de colonisation à l’hospitalisation et de la présence de GvHD En revanche, dans l’analyse de l’impact des infections à moisissures invasives prouvées et probables jusqu’au jour, le statut DECTIN- des deux Pour comparer les pourcentages entre groupes indépendants, nous avons utilisé le test exact de χtest ou de Fisher le cas échéant. Les différences dans la capacité de production de cytokines ont été testées par le test t de Student P & lt; a été considéré comme représentant une différence statistiquement significative

Résultats

Dépistage du polymorphisme DECTIN chez des individus sains La variation génétique du gène DECTIN- a été étudiée chez des volontaires sains hollandais et a révélé les polymorphismes montrés dans la figure. Un petit nombre de polymorphismes ont été identifiés, le YX rs en exon étant le seul polymorphisme exonique. en% des individus, qui étaient tous hétérozygotes, entraînant une fréquence allélique de% Ce polymorphisme a été identifié plus tôt dans une famille qui avait déjà été analysée pour une infection cutanée mucocutanée non publiée; les membres de cette famille étaient homozygotes pour le polymorphisme YX

Figure Vue en grandDivisionDessin schématique du gène DECTIN- également connu sous le nom de CLECA, constitué d’une queue Cytoplasmatic N-terminale Cyto, codée par l’exon, une région transmembranaire TM; exon, un exon de région de tige, et le domaine de reconnaissance des hydrates de carbone CRD; exon – Des polymorphismes introniques ont été détectés dans ‘UTR, intron, intron, exon, et’ UTR Toutes les variations sont représentées avec leur emplacement chromosomique correspondant et le nombre de rs, si disponibleFigure View largeDownload slideSchematic dessin du gène DECTIN- également connu sous le nom CLECA, composé d’une queue cytoplasmique N-terminale Cyto, codée par l’exon, une région transmembranaire TM; exon, un exon de région de tige, et le domaine de reconnaissance des hydrates de carbone CRD; exon – Des polymorphismes introniques ont été détectés dans ‘UTR, intron, intron, exon et’ UTR Toutes les variations sont représentées avec leur emplacement chromosomique correspondant et le nombre de rs, si disponibleDexpression de la protéine rectine Nous avons étudié la conséquence du polymorphisme sur l’expression de dectine et localisation au niveau protéique Les monocytes isolés d’individus homozygotes pour l’allèle DECTIN-type sauvage et d’individus hétérozygotes ou homozygotes pour le polymorphisme YX ont été analysés pour l’expression de la dectine par cytométrie de flux et microscopie confocale. Monocytes des individus homozygotes pour le YX le polymorphisme ne présentait pas d’expression de dectine sur la surface cellulaire, alors que les cellules d’individus hétérozygotes pour le polymorphisme YX présentaient une expression de surface cellulaire intermédiaire, comparée aux cellules d’individus avec l’allèle de type sauvage B Cependant, l’expression dectine-ARNm entre les données de génotypes non montrées Ainsi, ces découvertes démontrer que l’expression de la protéine dectine est absente de la membrane cellulaire des monocytes chez des individus homozygotes et intermédiaires sur des monocytes d’individus hétérozygotes pour le polymorphisme YX

Figure Vue largeDownload slide Graphiques de cytométrie de flux de coloration dectine extracellulaire A et B coloration confocale fluorescente du panel dectine-droite et de l’image microscopique gauche gauche sur des monocytes non stimulés dérivés d’individus homozygotes pour l’allèle DECTIN-type sauvage WT et hétérozygote HET ou homozygote HOM Diagrammes de cytométrie de fluorescence A et B coloration confocale fluorescente du panel dectine droite et de l’image au microscope optique gauche sur des monocytes non stimulés dérivés d’individus homozygotes pour l’allèle DECTIN-type sauvage WT et HET hétérozygote ou HOM homozygote pour le polymorphisme DECTINYX Production de cytokines Les conséquences fonctionnelles du polymorphisme YX ont été étudiées chez des monocytes et des PBMC isolés chez des individus portant uniquement l’allèle DECTIN-type sauvage et chez des individus hétérozygotes ou homozygotes pour le polymorphisme YX Interleukin IL- induction β par C albic ans était plus faible dans les cellules provenant d’individus portant le polymorphisme YX dopage. B En revanche, la production d’IL- et d’interféron IFN-γ n’était pas défectueuse dans les cellules isolées de ces individus, figure C; P = non significatif Bien qu’une tendance à une plus faible capacité de production d’IL ait été observée dans les cellules d’individus hétérozygotes pour YX, comparée aux cellules portant uniquement l’allèle DECTIN-type sauvage, ceci n’a pas atteint la signification statistique IL- production dans les cellules de les individus homozygotes pour la mutation YX étaient similaires à la production dans les cellules des individus avec l’allèle de type sauvage En outre, la capacité de production d’IFN-γ est pratiquement égale entre les génotypes

Figure Vue largeDownload diapositiveCytokine capacité de production de l’interleukine IL-β, IL- et interféron IFN-γ après la stimulation des monocytes au cours de h A ou des cellules mononucléaires du sang périphérique PBMCs h avec β-glucane, PamCys ou β-glucane / PamCys B ou avec Candida albicans C tué par la chaleur, on a obtenu des cellules à partir d’individus avec l’allèle de type sauvage WT; n = ou des individus hétérozygotes HET; n = ou HOM homozygote; n = pour le polymorphisme DECTIN-YX Les données sont des pourcentages comparés à WT ± écart type * P & lt; Figure Voir grandDownload slideCytokine capacité de production d’interleukine IL-β, IL-, et interféron IFN-γ après stimulation des monocytes pendant h A ou sang périphérique cellules PB mononucléaires pendant h avec β-glucane, PamCys, ou β-glucane / PamCys B ou avec des cellules C Candida albicans tuées par la chaleur ont été obtenus à partir d’individus avec l’allèle de type sauvage WT; n = ou des individus hétérozygotes HET; n = ou HOM homozygote; n = pour le polymorphisme DECTIN-YX Les données sont des pourcentages comparés à WT ± écart-type * Polymorphisme P & lt; DECTIN-YX chez les patients et les donneurs Le statut génétique DECTIN- pourrait être déterminé pour les patients et donneurs Des quantités insuffisantes d’ADN empêchaient la détermination de l’état génétique chez le patient et les donneurs Quinze% des patients et% des donneurs avaient le polymorphisme DECTIN-YX; Tous les individus étaient hétérozygotes Dans les couples patient-donneur, les deux individus étaient hétérozygotes pour le polymorphisme Il n’y avait pas de différences statistiquement significatives entre les caractéristiques cliniques des patients et des patients sans le tableau de polymorphisme DECTIN-YX Aucune différence dans la sévérité des mucites entre patients avec des patients sans le polymorphisme DECTINYX, avec un score moyen NNMSS de vs le jour et vs le jour P = non significatif. Colonisation par les aspartidés Sept patients ayant reçu une prophylaxie antifongique secondaire à l’hospitalisation ont été exclus de l’étude, de même que les patients manquant la colonisation Au moment de l’admission à l’hôpital,% des patients étaient colonisés avec des espèces Candida Les patients qui étaient hétérozygotes pour le polymorphisme YX étaient statistiquement significativement plus souvent colonisés que les patients avec les allèles DECTIN- type sauvage [%] de vs [%] de; P & lt; odds ratio [OR],; % intervalle de confiance [CI], – Après ajustement pour le diagnostic, le OR était% CI, -; après ajustement en fonction de l’âge et du sexe du patient, l’OR était% IC, – le jour du jour de la CSH, cette différence persistait:% de patients vs% de patients P = OR non corrigé% IC, – et OR ajusté pour diagnostic, Les patients présentant un polymorphisme DECTIN étaient plus susceptibles que les autres patients de recevoir du fluconazole [%] vs [%] de; P = tableau Parmi les patients ayant reçu du fluconazole, l’éradication a été réalisée chez% des patients hétérozygotes pour le polymorphisme YX, comparé au% des patients porteurs uniquement de l’allèle DECTIN-type sauvage. P = Espèces colonisatrices = C albicans% des patients , C glabrata%, et sporadiquement, C krusei, Candida kefyr, Candida parapsilosis et Candida dubliniesis% Aucune différence dans la fréquence de colonisation avec des espèces particulières de Candida n’a été observée entre les patients qui étaient hétérozygotes pour YX et ceux qui ne portaient que type DECTIN- allèle

Tableau View largeTélécharger slideObserved Colonisation des espèces de Candida et maladie fongique invasive chez les greffés de cellules souches hématopoïétiquesTable View largeTélécharger la diapositiveObserved Colonisation des espèces de Candida et maladie fongique invasive chez les greffés de cellules souches hématopoïétiques Maladie fongique envahissante Patients ayant reçu une prophylaxie antifongique précoce par itraconazole, voriconazole ou posaconazole, à partir du jour ou plus tôt et jusqu’au jour, ont été exclus les patients, dont avaient reçu la prophylaxie secondaire et qui avaient participé aux études antimicrobiennes L’incidence globale de la candidémie jusqu’au jour était% de patients Il n’y avait aucune différence statistiquement significative dans l’incidence de la candidémie précoce entre les patients avec et les patients sans le polymorphisme DECTIN-YX [%] de vs [%] de; P = table; Cependant, cette étude n’a pas été conçue pour détecter les différences dans le risque de développer une candidose invasive, car les patients qui ont été colonisés ont reçu du fluconazole pour prévenir l’infection systémique à Candida, et l’étude a été insuffisante pour trouver une différence. par C. albicans dans les cas, le reste des cas étant dû au cas de C glabrata, C parapsilosis et C dubliniesis Huit% des patients qui ont été colonisés et ont reçu du fluconazole ont présenté une candidémie Deux% des patients non colonisés et qui ont donc reçu Aucune fluconazole n’a présenté de candidémie L’incidence d’infection invasive prouvée et probable était de% des patients, avec des infections probables et non prouvées. Trois cas probables étaient dus aux espèces Aspergillus, et le cas probable était dû aux espèces Rhizomucor. Il n’y avait pas de différence statistiquement significative. entre des paires avec et sans polymorphisme DECTIN-YX; % de patients avec le polymorphisme YX avaient un cas probable, comparé à% des patients avec l’allèle DECTIN- type sauvage P = tableau Cependant, l’étude était sous-évaluée pour détecter une différence, en particulier en raison de la très faible incidence d’infection par moisissure

Discussion

Pour caractériser les conséquences fonctionnelles du polymorphisme YX de manière plus détaillée, la cytométrie de flux et la microscopie confocale ont été réalisées. L’expression de la dectine était absente sur la membrane cellulaire des cellules isolées des individus qui étaient homozygote pour l’allèle YX, qui suggérait un transport défectueux de la forme mutée de la dectine vers la membrane cellulaire. Par conséquent, l’expression de la dectine était intermédiaire sur les cellules des individus qui étaient hétérozygotes pour le polymorphismeAprès stimulation avec des albicanes ou β-glucanes tués par la chaleur , La sécrétion d’IL-β était intermédiaire dans des cellules isolées d’individus hétérozygotes pour le polymorphisme YX et faible dans les cellules d’individus homozygotes pour ce polymorphisme, comparée à la sécrétion dans des cellules d’individus homozygotes pour l’allèle sauvage. la synergie décrite précédemment entre les TLR et les signaux de dectine était complète Ces données démontrent l’effet de perte de fonction du polymorphisme YX sur l’activité de la dectine. Cependant, aucune différence dans la production d’IL- et d’IFN-γ n’a pu être observée entre les différents génotypes DECTIN. Ceci pourrait être dû à une certaine redondance de la signalisation de la dectine dans la production de ces cytokines, et cela s’accompagne d’une activité normale d’élimination de Candida par des neutrophiles d’individus portant les données de polymorphisme YX non représentées, aboutissant à une défense adéquate de l’hôte systémique. infections Dans le suivi de ces études génétiques et immunologiques, nous démontrons que ce polymorphisme a un impact significatif sur la colonisation de la muqueuse buccale et gastro-intestinale par les espèces Candida chez les receveurs de HSCT, ce qui définit le besoin d’utiliser le fluconazole dans notre approche. avec la découverte d’une candidose cutanéo-muqueuse récurrente dans une famille avec des individus homozygotes pour la DECTIN- morphisme données non publiées Le taux global de colonisation fongique à l’admission à l’hôpital était comparable à celui des études antérieures, avec des taux de colonisation de% -% Ces données soutiennent fortement le rôle des mécanismes médiés par la dectine pour la défense anti-Candida. Une augmentation de la susceptibilité à la colonisation muqueuse avec Candida chez les individus porteurs du polymorphisme DECTIN ne peut être définitivement identifiée, bien que les réponses cytokines défectueuses soient probablement impliquées Bien que les monocytes soient importants pour les défenses muqueuses, les cellules épithéliales peuvent également contribuer à ces effets. L’interaction de ces cellules avec des pathogènes fongiques conduit à la libération de chimiokines Il faut cependant considérer que dans le cadre de la HSCT, les monocytes et les cellules épithéliales de la muqueuse sont endommagés pendant une période prolongée. période, bien qu’ils soient en grande partie intacts à l’admission à l’hôpital et pendant les premiers jours de conditionnement D’autre part, les macrophages résidentiels de la muqueuse sont moins affectés, et il est fort probable que l’impact du polymorphisme DECTIN s’exerce à leur niveau. La présence du polymorphisme DECTIN n’a pas entraîné de L’incidence de la candidémie était prévisible, car la colonisation de la muqueuse est associée à une candidose systémique chez les patients atteints de HSCT qui subissent une lésion de la barrière muqueuse Il est important de noter que le fluconazole incidence de la candidémie Par conséquent, le fluconazole était probablement un facteur confondant, excluant une conclusion définitive concernant le rôle du polymorphisme DECTIN-YX dans la susceptibilité à la candidémie précoce, bien que nos données puissent suggérer un risque accru; En outre, notre étude était insuffisamment développée pour étudier l’impact du polymorphisme sur la survenue d’infections invasives dues à la moisissure en raison de la faible incidence de ces infections. Dans notre approche axée sur la culture, le fluconazole pouvait être retenu en toute sécurité. Cependant, les personnes colonisées présentaient un risque important de candidémie, ce qui nécessitait de meilleurs moyens de prédire, de déterminer et de traiter la colonisation à un stade précoce. Déterminer le statut de DECTIN avant la GCSH Étant donné que la colonisation à Candida est associée à une maladie invasive chez les receveurs de HSCT, nous proposons que les patients porteurs du polymorphisme soient considérés comme prophylactiques antifongiques pour prévenir la candidose systémique. Néanmoins, de futures études dans des essais prospectifs sont nécessaires pour confirmer davantage l’impact de ce polymorphisme DECTIN nouvellement caractérisé et pour définir son rôle dans la sélection d’une prophylaxie adéquate ou d’un traitement précoce chez les receveurs

Remerciements

Soutien financier MGN a été soutenu par une subvention Vidi de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit