Les réponses immunitaires entraînées par les allèles proteases de l’antigène des leucocytes humains provenant de non-promoteurs à long terme sont associées à un réservoir à faible taux de VIH dans les cellules T CD4 à mémoire centrale

Contexte Le contrôle immunitaire stable du virus de l’immunodéficience humaine VIH chez les LTNP non évolutifs à long terme avec des allèles HLA de l’antigène leucocytaire humain protecteur soulève la question de savoir si et comment ces allèles influencent la distribution immunitaire des réservoirs du VIH. sous-ensembles de cellules T CD4 au repos triés de 8 LTNPs avec et 10 sans allèles HLA-B * 27 ou HLA-B * 57 HLA-B27 / B57Résultats Un niveau d’infection remarquablement plus faible des cellules T CD4 à mémoire centrale TCM était une caractéristique exclusive qui distinguait Dans les LTNPs, la protection TCM était corrélée avec la conservation des comptes TCM, qui étaient positivement corrélés avec l’amplitude des lymphocytes T CD8 spécifiques du VIH Gag dans les LTNPs HLA-B27 / B57, une activation plus faible. niveau de leur mémoire CD4 T cellules a été associée à des quantités plus faibles de VIH-ADN cellulaire dans chaque sous-ensemble de la mémoire CD4 au repos et ont également été associés à des ratios plus élevés de CD8 T CD spécifique du VIH Gag En conséquence, les rapports E / T HLA-B27 / B57 étaient corrélés négativement avec la contribution des sous-ensembles de lymphocytes T CD4 mémoire aux réservoirs totaux du VIH. Conclusions L’immunité antivirale puissante régies par les allèles protecteurs HLA-B27 / B57, en limitant l’infection par TCM et l’épuisement du pool, sont associées à une contribution réduite du TCM au réservoir du VIH

Les gènes hôtes jouent un rôle déterminant dans le contrôle plurifactoriel efficace à long terme du virus de l’immunodéficience humaine. La réplication du VIH-1 observée chez certains individus infectés par le VIH, à savoir les non-promoteurs à long terme ou les contrôleurs d’élite. – Les allèles tels que l’antigène des leucocytes humains HLA-B * 27 et HLA-B * 57 HLA-B27 / B57 qui sont surreprésentés dans les LTNP et les EC [1-3] sont les facteurs les plus forts associés aux faibles taux plasmatiques d’ARN VIH et de l’ADN-VIH des cellules ADN-VIH associées aux cellules sanguines [4], on pense que ces derniers représentent les réservoirs du VIH et prédisent l’évolution de la maladie [5, 6] Ces gènes du CMH induisent rapidement une réponses lymphocytaires T CD8 polyfonctionnelles [7-10] mieux corrélées avec les taux d’ADN du VIH associés aux cellules [9, 11] qu’avec une faible charge virale plasmatique pVL [12] L’ADN du VIH associé aux cellules est principalement concentré dans les lymphocytes T CD4 , une population très hétérogène La dynamique complexe de L’activation, la prolifération et la mort des cellules T, qu’elles soient causées par la rencontre antigénique ou la prolifération homéostatique, semblent gouverner l’infection par les lymphocytes T CD4 du VIH et la persistance du virus [13] Les lymphocytes T CD4 faiblement différenciés ont été les principaux contributeurs pool de lymphocytes T CD4 infectés [14] et, plus spécifiquement, de 2 sous-ensembles majeurs de lymphocytes T CD4, les cellules de TCM centrale et de transition TTM, examinés sous traitement antirétroviral [15] Deux séries de résultats suggèrent un statut privilégié de TCM dans le contrôle viral Tout d’abord, leur nombre et leurs capacités fonctionnelles sont conservés dans les LTNP-EC [11, 16-18] Deuxièmement, les lymphocytes T CD8 spécifiques du virus de l’immunodéficience simienne SIV générés par la vaccination anti-SIV chez les macaques conservent un fort corrélat de la protection [19] Nous avons donc abordé les questions suivantes: 1 si les allèles HLA-B27 / B57 protecteurs associés au statut LTNP affectent la distribution du VIH dans le CD4 T-cel au repos l les stades de différenciation supposés représenter le réservoir du VIH, en particulier dans les cellules TCM, préservant ainsi leur nombre; et 2 quel serait le rôle de la réponse des lymphocytes T CD8 restreints par ces allèles dans un tel phénomène serait

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Sujets

Le groupe d’étude comprenait 18 LTNPs non traités Tableau 1 sélectionné parmi la cohorte ANRS CO15 précédemment décrite [2] et initialement recruté sur la base d’une infection asymptomatique au VIH depuis au moins 8 ans et de lymphocytes T CD4 supérieurs à 600 / mm3. Le nombre de lymphocytes T CD4 devait suivre une pente positive ou nulle pour les 5 dernières années; cependant, cette pente peut être modifiée après inclusion. Les 18 patients ont été classés selon leurs polymorphismes alléliques HLA-B comme LTNP-HLA-B27 / B57 et comme LTNP non-HLA-B27 / B57

Tableau 1 Caractéristiques des patients Polymorphismes Étude Durée Points Patients HLA-B CCR5 Année CD4 T Cellules VIH Groupe Nombre Premier Positif VIH Sérologie Δ32a / mm3% Plasma VIH-ARN, Copies / ml Cellule VIH-ADN, Copies / 106 PBMC Groupe entier n = 18 727 34 226 58 Médiane IQR 622-839 28-42 73-3804 13-298 LTNP-HLA-B * 27 et / ou B * 57 n = 8 # 02002 1985 50 57 – 1998b 1895 43 830 103 … … … … … 2008 1047 30 897 287 # 11020 1988 14 57 – 2000 1505 43 & lt; 40 12 # 02009 1986 51 57 2004 870 28 91 13 # 06002 1985 27 38 – 1996 828 39 299 5 # 11018 1988 57 18 1997 712 44 & lt; 40 13 # 08011 1986 27 27 – 1998 655 28 52 61 # 04054 1988 14 27 – 1998 565 41 107 33 # 09015 1988 7 57 2008 317 17 934 275 Médiane IQR 770 588-1346 40 28-43 99 43-697 23 12 -275 LTNP non-HLA-B * 27 et / ou B * 57 n = 10 # 04030 1985 51 44 – 1999 1011 35 154 25 # 11024 1989 14 40 – 1998 828 41 78 6 # 04002 1983 55 81 – 1996 818 42 1690 48 # 08005 1986 8 35 – 1995 790 31 60 85 # 05002 1983 35 14 – 1998 742 22 46 000 368 # 04046 1986 44 14 – 1999 690 47 101 55 # 11016 1988 13 38 2000 687 30 10 410 1026 # 04061 1986 14 18 – 1998 623 28 10 147 463 # 11005 1985 14 42 – 1995 618 18 17 800 422 # 04036 1987 5 8 1998 392 34 1075 117 Médiane IQR 716 622-820 33 27-41 1383 95-12 258 101 42-432 Polymorphismes Durée de l’étude Points Patients HLA-B CCR5 Année CD4 T Cellules VIH Nombre de groupe Premier positif Sérologie VIH Δ32a / mm3 % ARN-VIH plasmatique, copies / mL de cellules d’ADN-VIH, copies / 106 PBMCs Groupe d’étude entier n = 18 727 34 226 58 Médiane IQR 622-839 28-42 73-3804 13-298 LTNP-HLA-B * 27 et ou B * 57 n = 8 # 02002 1985 50 57 – 1998b 1895 43 830 103 … … … … … 2008 1047 30 897 287 # 11020 1988 14 57 – 2000 1505 43 & lt; 40 12 # 02009 1986 51 57 2004 870 28 91 13 # 06002 1985 27 38 – 1996 828 39 299 5 # 11018 1988 57 18 1997 712 44 & lt; 40 13 # 08011 1986 27 27 – 1998 655 28 52 61 # 04054 1988 14 27 – 1998 565 41 107 33 # 09015 1988 7 57 2008 317 17 934 275 Médiane IQR 770 588-1346 40 28 -43 99 43-697 23 12-275 LTNP non-HLA-B * 27 et / ou B * 57 n = 10 # 04030 1985 51 44 – 1999 1011 35 154 25 # 11024 1989 14 40 – 1998 828 41 78 6 # 04002 1983 55 81 – 1996 818 42 1690 48 # 08005 1986 8 35 – 1995 790 31 60 85 # 05002 1983 35 14 – 1998 742 22 46 000 368 # 04046 1986 44 14 – 1999 690 47 101 55 # 11016 1988 13 38 2000 687 30 10 410 1026 # 04061 1986 14 18 – 1998 623 28 10 147 463 # 11005 1985 14 42 – 1995 618 18 17 800 422 # 04036 1987 8 5 392 1998 34 117 1075 médian IQR 716 33 622-820 27-41 1383 95-12 258 101 42-432 Abréviations: le VIH, le virus de l’immunodéficience humaine; HLA, antigène leucocytaire humain; IQR, intervalle interquartile; LTNP, nonprogresseur à long terme; PMBCs, cellules mononucléées du sang périphériquea Délétion hétérozygotebTime considéré pour l’analyse statistique lorsque le patient a été testé à différents moments du suivi.

Etudes De Différenciation Des Cellules T CD4 Et Expériences De Tri Cellulaire

BDM Biosciences dans une installation L3 Quatre-vingt à 120 millions de cellules mononucléées de cellules du sang périphérique cryopréservées PBMC avec plus de 80% de viabilité après décongélation, évaluée par exclusion au bleu trypan, ou au moins 50 × 106 PBMC fraîches ont été colorées avec les combinaisons d’anticorps suivantes: Pacifique-Blue-CD3 UCHT1, Alexa700-CD4 RPA-T4, Cy7PE-CCR7 3D12, allophycocyanine-CD27 L128, phycoérythrine PE-CD127 IL7R-M21, PE-CCR5 2D7, fluorescéine isothiocyanate FITC-CD69 L78 et -HLA-DR L243; BD Pharmingen, colorant couplé à l’énergie CD45RA 2H4 et FITC-CD25 B1499; Beckman Coulter Les cellules T CD25-, CD69-, HLA-DR-CD4 au repos médianes, 93% des lymphocytes T CD4 totaux ont été triés comme CD4 naïfs au repos: CD45RACCR7CD27 et cellules de mémoire, y compris TCM central: CD45RA-CCR7CD27, TTM transitionnel: CD45RA-CCR7-CD27 et cellules effectrices TEM: cellules CD45RA-CCR7-CD27- Les cellules CD4 CD45RACCR7- d’Effecteur CD4 ont été triées en fonction de leur expression CD27 comme TE27- et TE27 Figure 1 supplémentaire Si possible, un minimum de 05 × 106 cellules de Bien que Ficoll utilisé pour isoler les cellules puisse affecter l’expression de CCR5, nous supposons une comparaison de l’expression de CCR5 entre les sous-ensembles de lymphocytes T CD4 analysés dans le même tube à essai. est valide FlowJo TreeStar, Inc a été utilisé pour analyser les données

Quantification du VIH-ADN par cellule ultrasensible

L’ADN du VIH cellulaire a été quantifié par PCR en temps réel par polymérase ultra-sensible comme décrit précédemment [27, 28] L’ADN total a été extrait de chaque sous-ensemble trié, et l’extraction entière a été testée dans 2-4 PCR. nombre de copies / 106 cellules ou comme valeur seuil de détection lorsque l’ADN du VIH n’a pas été détecté. Le manque de détectabilité peut être lié soit à un nombre insuffisant de cellules triées, soit au niveau d’infection faible. Les seuils varient selon le nombre de cellules disponibles et ont été calculées pour chaque dosage [28]

Réponses des lymphocytes T CD8 au VIH Gag

Les cellules CD8 spécifiques du VIH ont été quantifiées avec un test ELISPOT immuno-enzymatique [11], avec des pools de peptides synthétiques 15-mer chevauchant 11 acides aminés Neosystem et couvrant HIV-Gag [133-187] et HIV-Gag [221 -275] séquences Les 8 LTNP HLA-B27 / B57 et les 10 LTNP non-HLA-B27 / B57 présentaient des molécules HLA capables de présenter une moyenne de 8 épitopes de ces régions. Base de données Los Alamos L’origine cellulaire CD8 de l’interféron γ a été démontrée après des billes magnétiques d’appauvrissement en CD8 anti-CD8; Dynabeads, Dynal par ELISPOT et / ou par coloration intracellulaire des cytokines chez 6 des 8 patients avec HLA-B27 / 57 et 8 sur 10 patients non-HLA-B27 / 57 Les réponses des lymphocytes T CD8 spécifiques à Gag ne sont pas présentées pour 2 des 18 patients en raison du manque de cellules disponibles Nous avons calculé une cellule E / T effectrice / cible, rapport E / T, en divisant le nombre de cellules T CD8 anti-Gag par le nombre de cellules T CD4 infectées à partir d’un sous-ensemble donné Cette E / T On pensait que le rapport représentait le nombre de cellules T CD8 anti-Gag qui étaient capables de cibler un TCM T CD4 infecté, TTM, ou TEM

Analyses statistiques

Des tests bilatéraux Mann-Whitney U ont été utilisés pour comparer les médianes entre les groupes de patients, et des tests appariés de Wilcoxon bilatéraux ont été utilisés pour comparer les médianes entre les sous-ensembles de cellules AP valeur supérieure à celle calculée selon la méthode de correction Les corrélations entre les variables ont été déterminées avec le test de rang de Spearman. Les valeurs seuils calculées lorsque le nombre de copies d’ADN-VIH étaient indétectables ont été exclues de toute analyse statistique n = 7 sur 18 pour TN; n = 1 sur 18 pour TCM; n = 2 sur 18 pour TTM Notez que nous avons systématiquement vérifié les résultats et n’avons pas modifié les valeurs de seuil s’ils ont été inclus dans l’analyse statistique. Les graphiques ont été générés à l’aide du logiciel GraphPad Prism 50

RÉSULTATS

Infection limitée par le VIH de la TCM au repos dans les LTNPs avec des allèles protecteurs HLA-B27 / B57

Pour analyser si les allèles HLA protecteurs pourraient influencer la distribution du VIH-ADN dans les sous-populations de lymphocytes T CD4 au repos, nous avons sélectionné 18 LTNP de la cohorte LTNP [2], dont 8 HLA-B27 / B57-positifs et 10 non-HLA -B27 / B57 LTNPs Tableau 1 Entre ces 8 et 10 patients sélectionnés, l’ADN du VIH cellulaire et le nombre de CD4 n’étaient pas significativement différents, mais les différences étaient significatives avec seulement le pVL Figure 2 au repos CD69-, CD25- et HLA-DR – Les cellules T CD4 ont été triées en fonction de leur statut de différenciation dans les TN naïfs, les mémoires TCM, TTM et TEM, et les cellules TE27 effectrices TE27 définies par leur expression CD45RA, CCR7 et CD27 Figure 1 supplémentaire chez les patients avec HLA-B27 / B57, le niveau d’infection TCM extrêmement faible ne différait pas de celui de TN et médiane TEM = 257, 255 et 282 copies de VIH-ADN cellulaire / million de cellules, respectivement, mais il était significativement plus faible que le TTM un P = 0313; Figure 1A Cette distribution exquise observée dans les LTNPs HLA-B27 / 57, à savoir un niveau inférieur d’infection TCM, était indépendante des comptes CD4 ou des données pVL non montrées. De plus, chez 1 patient avec HLA-B * 57, nous avons pu montrer que cette cellule En revanche, chez les patients sans HLA-B27 / B57, les cellules TCM étaient aussi infectées que celles en TTM médiane = 1905 et 1820 copies VIH-ADN cellulaire / million de cellules, respectivement et étaient significativement plus que ceux dans TN 1 log inférieur à TCM et TTM; P = 0078 En conséquence, la hiérarchie de la distribution du VIH-ADN cellulaire entre les sous-ensembles de lymphocytes T CD4 dans HLA-B27 / B57 et non-HLA-B27 / B57 différait exclusivement par un niveau d’infection HLA-B27 / B57 10 fois plus faible Cellules TCM P = 0081

Figure 1View largeDownload slideCentrale mémoire CD4 cellules T TCM protection contre l’infection par le VIH dans HLA-B * 27 et / ou HLA-B * 57 HLA-B27 / B57 nonprogresseurs à long terme Un impact des polymorphismes de l’allèle HLA-B sur la distribution immunitaire de la cellule ADN du VIH associé L’ADN du VIH total des cellules a été quantifié dans des sous-ensembles de cellules T CD25 CD25-CD69-HLA-DR CD4 au repos naïfs [TN: CD45RACCR7CD27] et sous-ensembles mémoire: [TCM: CD45RA-CCR7CD27], [TTM: CD45RA-CCR7- CD27], [TEM: CD45RA-CCR7-CD27-] par réaction en chaîne par polymérase ultrasensible en temps réel et est exprimée en tant que copies cellulaires ADN-VIH / 106 sous-ensembles cellulaires Huit patients avec HLA-B * 57 et / ou HLA-B * 27 allèles points rouges sont comparés avec 10 patients avec d’autres points HLA-B points gris Symboles remplis, nombre de copies cellulaires VIH-ADN; symboles ouverts, niveaux inférieurs au seuil de détection calculé pour chaque test en fonction du nombre de cellules disponibles Les valeurs seuils ont été exclues de l’analyse statistique B, Haut: L’expression CCR5 est représentée pour chaque sous-ensemble comme le pourcentage médian de cellules positives et l’intensité moyenne de fluorescence; en bas: proportion de cellules exprimant CCR5 dans les points rouges HLA-B27 / B57 et les points gris non-HLA-B27 / B57Abbreviations: VIH, virus de l’immunodéficience humaine; HLA, antigène leucocytaire humain; MFI, Median Fluorescence IntensityFigure 1View largeTélécharger la diapositiveCentrer les lymphocytes T CD4 de la mémoire centrale TCM protection contre l’infection par le VIH chez HLA-B * 27 et / ou HLA-B * 57 HLA-B27 / B57 nonprogresseurs à long terme Un impact des polymorphismes alléliques HLA-B sur le Distribution immunitaire de l’ADN du VIH associé à la cellule L’ADN du VIH total de la cellule a été quantifié dans des sous-ensembles CD25 CD69-CD69-HLA-DR CD4 au repos naïfs [TN: CD45RACCR7CD27] et sous-ensembles mémoire: [TCM: CD45RA-CCR7CD27], [TTM: CD45RA-CCR7-CD27], [TEM: CD45RA-CCR7-CD27-] par réaction en chaîne par polymérase ultrasensible en temps réel et est exprimée en tant que copies de VIH-ADN cellulaire / 106 sous-ensembles de cellules Huit patients avec HLA-B * 57 et / ou HLA -B * 27 points rouges d’allèles sont comparés avec 10 patients avec d’autres points HLA-B points gris Symboles remplis, nombres de copies de VIH-ADN de cellule; symboles ouverts, niveaux inférieurs au seuil de détection calculé pour chaque test en fonction du nombre de cellules disponibles Les valeurs seuils ont été exclues de l’analyse statistique B, Haut: L’expression CCR5 est représentée pour chaque sous-ensemble comme le pourcentage médian de cellules positives et l’intensité moyenne de fluorescence; en bas: proportion de cellules exprimant CCR5 dans les points rouges HLA-B27 / B57 et les points gris non-HLA-B27 / B57Abbreviations: VIH, virus de l’immunodéficience humaine; HLA, antigène leucocytaire humain; MFI, Intensité Médiane de Fluorescence Nous avons ensuite analysé si les faibles niveaux d’infection de HLA-B27 / B57 TCM étaient influencés par de faibles différences d’expression pVL ou CCR5 Premièrement, alors que le taux d’infection TTL / MTC était significativement plus élevé chez les HLA-B27 / B57 P = 0233; Figure 4 supplémentaire, ce rapport restait similaire chez les 8 contrôleurs du VIH versus 10 LTNP virémiques avec des pVL <200 et> 200 copies / mL, respectivement, indépendamment de leur HLA, ce qui indiquait qu’une infection TCM extrêmement faible était une caractéristique unique Deuxièmement, cette différence unique pourrait ne pas refléter des proportions plus faibles de CCR5 exprimant la TCM dans les LTNPs HLA-B27 / B57, qui ne différaient pas de leurs homologues non-HLA-B27 / B57 non-HLA-B27 / B57. Figure 1B, top En outre, la hiérarchie des sous-populations de lymphocytes T CD4 reflète non seulement des différences dans l’expression de CCR5 parce que les CCR5high TEM ne sont pas les principales cibles de VIH Figure 1B, bas Enfin, une suppression hétérozygote de 32 paires de bases dans le gène ccr5 observé chez 5 patients Le tableau 1 n’a pas affecté la distribution de l’ADN du VIH cellulaire parmi les sous-ensembles de CD4 Figure 5 supplémentaire Globalement, ni l’expression pVL ni l’expression de CCR5 n’expliquent les différences dans les niveaux d’infection TCM. l L’ADN du VIH dans les sous-populations de lymphocytes T CD4 au repos représentait un réservoir de VIH inductible, étant donné que l’ADN du VIH cellulaire détecté dans les lymphocytes T CD4 au repos reflète l’ADN intégré chez les patients à faible pVL [15, 20]. obtenu après une activation du complexe des récepteurs des lymphocytes T CD3 / CD28 dans chaque sous-groupe trié Figure 6 supplémentaire et d’au moins 1 sous-ensemble chez tous les patients testés, y compris les contrôleurs du VIH LTNPs

Une infection limitée par le VIH de la TCM au repos est associée à une augmentation de la taille du pool TCM et à un plus grand nombre de cellules T CD8 anti-gag

Nous avons ensuite observé que les patients avec les plus grands pools TCM avaient les niveaux les plus bas d’infection TCM P = 0005; La figure 2A HLA-B27 / B57 a clairement influencé les nombres de TCM parce que 6 des 8 patients avec HLA-B27 / B57 mais seulement 3 des 9 patients sans HLA-B27 / B57 avaient un nombre de TCM supérieur à la valeur médiane LTNP de 134 TCM / mm3 2A et supplémentaire Figure 7 Une telle influence HLA-B27 / B57 unique sur les niveaux d’infection TCM et les comptes nous a conduit à tester le rôle des lymphocytes T CD8 anti-VIH HLA-B27 / B57 dans ce phénomène chez ces individus, nous avons précédemment montré que les épitopes ciblés sur les lymphocytes T CD8 spécifiques de Gag restreints par HLA-B * 27 [9] ou HLA-B * 57 [21] dans les régions 2 Gag, [133-187] et [221-275] Ces 2 régions ont également contenu des épitopes restreints par d’autres allèles HLA-B reconnus par les lymphocytes T CD8 spécifiques de Gag à partir des 10 données non-HLA-B27 / B57 du LTNPs non montrées. Les réponses spécifiques de Gag étaient significativement plus élevées chez les patients HLA-B27 / 57 autres P = 007; données non montrées et négativement corrélées avec le niveau d’infection TCM Figure 2B La même tendance a été observée pour les niveaux d’infection TTM et TEM, bien que les niveaux aient été significatifs seulement dans TEM Figure 8 supplémentaire, milieu, ce qui suggère que l’influence du T CD8 anti-Gag Lorsque nous avons analysé la relation entre les réponses des lymphocytes T CD8 spécifiques de Gag et chaque taille de sous-ensemble des lymphocytes T CD4, seules les cellules TCM comptent Figure 2C, mais pas celles de TTM ou TEM Figure 8 , à droite, étaient positivement corrélés avec le nombre de lymphocytes T CD8 anti-Gag Ainsi, l’accumulation de TCM non infectée était principalement observée chez les patients atteints de HLA-B27 / B57 avec un nombre élevé de lymphocytes T CD8 anti-Gag.

Figure 2View largeDownload slideUnique relation entre la mémoire centrale CD4 lymphocytes T Taille du pool TCM, niveaux d’infection et réponses T CD8 anti-Gag Corrélations entre les niveaux d’infection TCM et leurs comptes, B entre les niveaux d’infection TCM et les fréquences des cellules T CD8 répondant à Gag [133-187] [221-275] compte, et C entre les fréquences des lymphocytes T CD8 répondant aux déterminations Gag [133-187] [221-275] et TCM Les sous-ensembles de cellules avec l’ADN VIH indétectable ont été exclus des corrélations; par conséquent, 17 patients ont été présentés dans A, 15 patients ont été présentés dans B, et 16 patients ont été présentés dans C Corrélations ont été déterminées avec le test de rang de Spearman Les points rouges représentent HLA-B * 27 et / ou HLA-B * 57 HLA-B27 / Les patients B57 et les points gris représentent les patients non-HLA-B27 / B57. Abréviations: VIH, virus de l’immunodéficience humaine; PBMCs, cellules mononucléaires du sang périphérique Figure 2View largeTélécharger la diapositive Relation unique entre la mémoire centrale Cellules T CD4 Taille du pool TCM, niveaux d’infection et réponses anti-Gag CD8 T-cell Corrélations entre les niveaux d’infection TCM et leurs comptes, B entre les niveaux d’infection TCM et les fréquences de Cellules T CD8 répondant aux comptages Gag [133-187] [221-275], et C entre les fréquences des lymphocytes T CD8 répondant aux numérations Gag [133-187] [221-275] et TCM Les sous-ensembles cellulaires avec un ADN VIH indétectable ont été exclus des corrélations; par conséquent, 17 patients ont été présentés dans A, 15 patients ont été présentés dans B, et 16 patients ont été présentés dans C Corrélations ont été déterminées avec le test de rang de Spearman Les points rouges représentent HLA-B * 27 et / ou HLA-B * 57 HLA-B27 / Les patients B57 et les points gris représentent les patients non-HLA-B27 / B57. Abréviations: VIH, virus de l’immunodéficience humaine; PBMC, cellules mononucléées du sang périphérique

Les cellules T CD8 anti-gag HLA-B * 27 ou HLA-B * restreintes affectent la contribution des cellules T CD4 mémoires au réservoir du VIH

Nous avons ensuite calculé la contribution de chaque sous-ensemble de lymphocytes T CD4 infectés au réservoir total de VIH mesuré en intégrant la taille du sous-ensemble à son niveau d’infection par le VIH. Le profil des contributions du réservoir VIH différait entre les deux groupes de patients: chez les patients HLA-B27 / B57, moyenne TTM, 563%; La figure 3A a contribué 2 fois plus que la moyenne TCM, 261% au réservoir total de VIH, alors que chez les patients non-HLA-B27 / B57, les contributions TCM et TTM étaient similaires 401% et 393%, respectivement

Figure 3View largeDownload slideImpact des lymphocytes T CD8 anti-Gag sur la mémoire centrale infectée CD4 cellules TCM TCM, cellules de mémoire transitionnelles TTM, et des cellules effectrices mémoires sous-ensembles TEM au réservoir VIH Une contribution des sous-ensembles de cellules TCM, TTM et TEM à la ADN total VIH-ADN mesuré dans tous les sous-ensembles de lymphocytes T CD4 médiane B Corrélation chez les patients HLA-B * 27 et HLA-B * 57 HLA-B27 / B57 et non-HLA-B27 / B57 entre 1 les rapports estimés entre anti- Gag [133-187] [221-275] lymphocytes T CD8 et TCM, TTM et TEM infectés, désignés par rapport effecteur / cible E / Tsubset cible; et 2 la contribution des sous-ensembles TCM, TTM et TEM à l’ADN total du VIH cellulaire mesuré dans tous les sous-ensembles de lymphocytes T CD4. Les lignes pointillées représentent le rapport E / Tsubset médian pour TCM, TTM et TEM Les corrélations ont été déterminées à l’aide de Spearman. test de classementAbbreviations: VIH, virus de l’immunodéficience humaine; HLA, antigène leucocytaire humainFigure 3View largeTélécharger la diapositive Effet des cellules T CD8 anti-Gag sur la mémoire centrale infectée Cellules T CD4 TCM, cellules mémoires transitionnelles TTM et cellules mémoires effectrices Contributions au sous-ensemble TEM au réservoir VIH A Contribution du TCM, du TTM et du TEM sous-ensembles cellulaires à l’ADN du VIH total cellulaire mesurée dans tous les sous-ensembles de lymphocytes T CD4 médiane B Corrélation dans HLA-B * 27 et HLA-B * 57 HLA-B27 / B57 et non-HLA-B27 / B57 entre 1 les ratios estimé entre les lymphocytes T CD8 anti-Gag [133-187] [221-275] et TCM, TTM et TEM infectés, dénommé rapport effecteur / cible E / Tsubset; et 2 la contribution des sous-ensembles TCM, TTM et TEM à l’ADN total du VIH cellulaire mesuré dans tous les sous-ensembles de lymphocytes T CD4. Les lignes pointillées représentent le rapport E / Tsubset médian pour TCM, TTM et TEM Les corrélations ont été déterminées à l’aide de Spearman. test de classementAbbreviations: VIH, virus de l’immunodéficience humaine; HLA, antigène leucocytaire humainPour mieux comprendre comment les réponses antivirales des lymphocytes T CD8 peuvent influencer la distribution du réservoir du VIH, nous avons calculé le nombre de lymphocytes T CD8 anti-Gag par sous-ensemble de cellules infectées; c’est-à-dire, le rapport E / T, qui dans l’infection SIV a été rapporté pour prédire l’issue de la maladie [22] Pour ce faire, nous avons supposé que la majorité des cellules infectées au repos abritent 1 copie de l’ADN du VIH. Figure 3B, ligne en pointillé Ce rapport E / Tsubset était significativement corrélé avec le profil de contribution du réservoir de VIH de tous les sous-ensembles de lymphocytes T CD4 de mémoire P = 0028; r = -06067 uniquement dans les LTNPs HLA-B27 / B57 Cette corrélation était indépendante du nombre de pVL ou de CD4 chez les patients avec HLA-B27 / 57 Figure 9 supplémentaire

Relation entre les niveaux d’activation et d’infection des sous-ensembles de lymphocytes T CD4 au repos et des lymphocytes T CD8 anti-gag

Nous avons exploré comment HLA-B et le système immunitaire des lymphocytes T CD8 spécifiques du VIH pourraient moduler ce niveau inférieur d’infection TCM en analysant l’activation des lymphocytes T CD4 mémoire, une force motrice prédisposant à l’infection [24] et augmentant le renouvellement cellulaire et l’épuisement [ 25] Lors de l’analyse de l’expression des CD25, CD69 et HLA-DR par les sous-populations de lymphocytes T CD4, aucune différence n’a été observée entre les 2 groupes médians des LTNP: 103% des lymphocytes T CD4 totaux Figure 4A Les niveaux d’infection dans les sous-populations de lymphocytes T CD4 reposant sur la mémoire HLA-B27 / B57 étaient significativement plus faibles que dans les cellules non HLA-B27 / B57 seulement lorsque la proportion de lymphocytes T CD4 à mémoire activée dans le sous-ensemble était inférieure à 1% Figure 4B; P = 0083 Lorsque les réponses immunitaires anti-VIH ont été considérées, nous avons trouvé que le rapport E / Tsubset était significativement plus élevé pour les sous-ensembles HLA-B27 / B57 avec moins de 1% de lymphocytes T CD4 à mémoire active P = 0161; Figure 4C, alors que ce n’était pas le cas pour les sous-ensembles non-HLA-B27 / B57

Figure 4View largeDownload slideInfluence des allèles HLA-B * 27 et / ou HLA-B * 57 HLA-B27 / B57 sur la différenciation TCM, l’activation et l’infection par le VIH A Pourcentage de HLA-B27 / B57 et non-HLA-B27 / B57 central cellules mémoire CD4 TCM ou cellules mémoire transitoires TTM ou cellules mémoire effectrices TEM exprimant au moins 1 marqueur d’activation CD25, CD69, HLA-DR B HLA-B27 / B57 et non-HLA-B27 / B57 au repos TCM ou TTM ou TEM selon la proportion de cellules activées dans le sous-ensemble C HLA-B27 / B57 et non-HLA-B27 / B57 au repos TCM ou TTM ou TEM E / Tsubset ratio selon la proportion de cellules activées dans le sous-groupe Abréviations: VIH, virus de l’immunodéficience humaine ; HLA, antigène leucocytaire humainFigure 4View largeTélécharger slideInfluence des allèles HLA-B * 27 et / ou HLA-B * 57 HLA-B27 / B57 sur la différenciation TCM, l’activation et l’infection par le VIH A Pourcentage de HLA-B27 / B57 et non-HLA- Mémoire centrale B27 / B57 Cellules T CD4 TCM ou cellules mémoires transitoires TTM ou cellules mémoires effectrices TEM exprimant au moins 1 marqueur d’activation CD25, CD69, HLA-DR B HLA-B27 / B57 et non-HLA-B27 / B57 au repos TCM ou TTM ou taux d’infection TEM selon la proportion de cellules activées dans le sous-ensemble C HLA-B27 / B57 et non-HLA-B27 / B57 au repos TCM ou TTM ou TEM E / Tsubset ratio selon la proportion de cellules activées dans le sous-groupe Abréviations: VIH , virus de l’immunodéficience humaine; HLA, antigène leucocytaire humain

DISCUSSION

Cette étude démontre que 2 allèles protecteurs du CMH-I, HLA-B * 27 et HLA-B * 57, marquent fortement la taille du réservoir de VIH et sa distribution en préservant partiellement le compartiment TCM sans affecter les autres sous-ensembles de lymphocytes T CD4. la conservation ne semble pas refléter les différences d’expression de pVL ou de CCR5, mais elle reflète les réponses robustes des cellules T CD8 contre le Gag du VIH observées dans les LTNPs HLA-B27 / B57. L’effet protecteur de HLA-B * 27 ou HLA- * B57 sur le le niveau d’infection et les nombres du sous-ensemble TCM nécessitent une combinaison unique de privilèges homéostatiques TCM et de puissants lymphocytes T CD8 anti-Gag: 1 nombre élevé de lymphocytes T CD8 anti-Gag HLA-B27 / B57 maintiennent les niveaux d’infection bas dans les cellules T CD4 paramètres où 2 la faible activation affecte l’infection de leurs homologues au repos, permet le maintien de la capacité de renouvellement TCM, et donc l’accumulation de cellules TCM non infectéesLe contenu VIH-ADN remarquablement faible, nous avons mesuré, avec nos nombres limités de repos triés Les cellules CD4 ne nous ont pas permis d’analyser l’ADN-VIH intégré et ont limité nos investigations à l’ADN-VIH total dans les cellules triées. Cependant, l’ADN-VIH cellulaire détecté dans les lymphocytes T CD4 au repos reflète l’ADN intégré chez les patients faible pVL [15, 20] Les niveaux extrêmement faibles d’ADN-VIH cellulaire détectés dans les PBMC HLA-B27 / B57 contrastaient avec des niveaux plus élevés de copies totales d’ADN-VIH dans les suppresseurs d’élite HLA-B27 / B57 [26] pour mesurer les niveaux d’ADN-VIH dans notre étude est une technique de PCR quantitative standardisée et hautement sensible [27, 28], largement validée dans différentes cohortes [5, 11, 29] et utilisée quotidiennement pour le diagnostic de l’infection à VIH chez le nouveau-né. La conservation de TCM-B27 / B57 contraste avec les observations de patients avirémiques traités chez lesquels les sous-groupes TCM et TTM étaient également infectés [15] Nous avons observé des profils d’infection TCM et TTM similaires chez des non-HLA-B27 / B57 contrôleurs du VIH non indétectables virus plasmatique, ce qui confirme notre conclusion selon laquelle l’infection à TCM inférieure observée dans les LTNP HLA-B27 / B57 ne reflète pas simplement un faible pVL. Ce rôle exquis du HLA-B * 27 et du HLA-B * 57 est confirmé par le nombre élevé de HLA-B27 Les cellules T CD8 anti-Gag restreintes B57, leur grande avidité ou polyfonctionnalité [7-10] qui exercent une pression immunitaire sur tous les sous-ensembles de lymphocytes T CD4 infectés, comme le montre leur corrélation avec l’ADN du VIH cellulaire contenu dans les PBMC totales [ Cependant, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que des mécanismes de contrôle immunitaire supplémentaires, tels que les cellules tueuses naturelles [30], pourraient également aider à préserver le compartiment TCM dans HLA-B * 57 LTNPsIn 1 HLA-B * 57- LTNP positif avec des cellules T CD8 anti-Gag puissantes et stables, de faibles niveaux d’infection TCM ont été maintenus pendant au moins 10 ans, ainsi que la distribution du VIH-ADN parmi les sous-ensembles. L’immunité spécifique au VIH HLA-B27 / B57 peut contribuer à la conservation TCM [8, 10, 31], et il évoque la conservation du compte TCM observée après provocation par SIV chez les macaques vaccinés avec des cellules T CD8 anti-Gag [19], bien que les niveaux d’infection TCM restent inconnus dans ces cas. La conservation de la MTC HLA-B27 / 57 contraste avec leur déplétion au cours de la progression vers le syndrome d’immunodéficience acquise, qui est censé refléter une conversion accélérée de TCM en TTM / TEM [32] Une telle conservation TCM contribuerait probablement plus au maintien du long terme la stabilité du compartiment entier CD4 que d’autres sous-ensembles en raison de leurs propres propriétés homéostatiques, à savoir, potentiel clonogénique élevé [33] et demi-vie longue [34] Parce que l’homéostasie des cellules T CD4 est influencée par l’activation des cellules Influence l’infection cellulaire [24] et expose les cellules aux lymphocytes T CD8 antiviraux lytiques [35], nous proposons un modèle Figure 5 dans lequel un contexte spécifique MHC-I conduit puissant anti-Gag CD8 cellule T Ainsi, les caractéristiques homéostatiques uniques du sous-ensemble TCM permettent la traduction des cellules T CD8 anti-Gag, ce qui contribue à limiter les événements d’infection VIH et à éliminer tous les lymphocytes T CD4 répliquant activement le virus, préservant les numéros de TCM et diluant les TCM infectés. Une protection TCM similaire a été récemment signalée chez des hôtes naturels de SIV comme mangabeys fuligineux, en association avec une induction plus faible de CCR5 après activation cellulaire [36] Parce que ces singes ont généralement une faible immunité antivirale et une pVL élevée, nous suggérons l’ampleur des réservoirs de TCM reflète exquisement divers mécanismes de contrôle de la maladie, indépendamment de la pVL

Figure 5View largeDownload slideRelationship entre les lymphocytes T CD8 anti-Gag, la mémoire centrale plus lente CD4 cellules TCM, la différenciation et l’activation conduit à des niveaux inférieurs d’infection TCM et une contribution moindre au réservoir de VIH chez les individus avec HLA-B * 27 et / ou HLA -B * 57 HLA-B27 / B57 Ce schéma illustre notre hypothèse sur les mécanismes qui protègent la TCM dans les LTNPs HLA-B27 / B57. Dans le panneau de gauche, les LTNPs HLA-B27 / B57 ont montré de nombreux [9, 22] anti- Gag CD8 T et faibles proportions de TCM activée Ces 2 facteurs limitent fortement la probabilité d’infection par TCM ou la possibilité de survie d’une TCM infectée et permettent une élimination rapide des cellules productives infectées. la différenciation de TCM vers des cellules mémoires effectrices TEM, qui se produit habituellement en l’absence de contrôle viral [33], est limitée; et 2 les principales caractéristiques intrinsèques de TCM, à savoir, potentiel clonogénique élevé [35] et demi-vie longue [36], sont maintenues dans ce contexte et permettent un auto-renouvellement sûr et l’accumulation de MTC non infectées. La TCM chez ces patients semble être extrêmement faible, et le sous-ensemble TCM contribue moins au réservoir de VIH qu’au sous-ensemble TTM de la cellule de transition conduction. Sur le panneau de droite, la proportion de TCM non HLA-B27 / B57 que dans le TCM HLA-B27 / B57, mais moins de cellules T CD8 anti-Gag puissantes ont été trouvées chez ces patients. Par conséquent, ils avaient une proportion significativement plus élevée de TCM infectée. Ce contrôle viral inférieur apparent chez les non-HLA-B27 / B57 conduit à une plus grande sur-différenciation de TCM vers TEM Une plus petite proportion de cellules TCM est alors capable d’auto-renouvellement sûr Enfin, la proportion de TCM infecté est plus élevé que chez les patients HLA-B27 / B57, et TCM contribuent autant que TTM à le réservoir du VIHAbbreviatio ns: VIH, virus de l’immunodéficience humaine; Relation entre les lymphocytes T CD8 anti-Gag, la mémoire centrale plus lente Les lymphocytes T CD4 TCM, la différenciation et l’activation ont conduit à des niveaux plus bas d’infection TCM et une contribution moindre au réservoir de VIH chez les individus atteints de HLA-B * 27 et / ou HLA-B * 57 HLA-B27 / B57 Ce schéma illustre nos hypothèses sur les mécanismes qui protègent la TCM dans les LTNPs HLA-B27 / B57. Dans le panneau de gauche, les LTNPs HLA-B27 / B57 ont montré de nombreux et puissants [9, 22] lymphocytes T CD8 anti-Gag et faibles proportions de TCM activée Ces 2 facteurs limitent fortement la probabilité d’infection de TCM, ou la possibilité d’une TCM infectée de survivre, et permettent une élimination rapide des cellules infectées productivement. 1 la sur-différenciation de TCM vers les cellules mémoires effectrices TEM, qui se produit habituellement en l’absence de contrôle viral [33], est limitée; et 2 les principales caractéristiques intrinsèques de TCM, à savoir, potentiel clonogénique élevé [35] et demi-vie longue [36], sont maintenues dans ce contexte et permettent un auto-renouvellement sûr et l’accumulation de MTC non infectées. La TCM chez ces patients semble être extrêmement faible, et le sous-ensemble TCM contribue moins au réservoir de VIH qu’au sous-ensemble TTM de la cellule de transition. Sur le panneau de droite, la proportion de TCM non HLA-B27 / B57 que dans le TCM HLA-B27 / B57, mais moins de cellules T CD8 anti-Gag puissantes ont été trouvées chez ces patients. Par conséquent, ils avaient une proportion significativement plus élevée de TCM infectée. Ce contrôle viral inférieur apparent chez les non-HLA-B27 / B57 conduit à une plus grande sur-différenciation de TCM vers TEM Une plus petite proportion de cellules TCM est alors capable d’auto-renouvellement sûr Enfin, la proportion de TCM infecté est plus élevé que chez les patients HLA-B27 / B57, et TCM contribuent autant que TTM à le réservoir du VIHAbbreviatio ns: VIH, virus de l’immunodéficience humaine; Cependant, les taux d’infection dans les PBMC et les compartiments muqueux sont fortement corrélés [15, 28], et les lymphocytes T CD8 spécifiques du VIH sont également fortement concentrés dans les organes lymphoïdes (HLA, antigène leucocytaire humain). [37, 38]; Par conséquent, le rapport des cellules T CD8 effectrices spécifiques du VIH aux cellules infectées par le VIH dans les tissus pourrait rester similaire. Nous fournissons de nouvelles informations sur le contrôle des réservoirs du VIH dans la TCM dans le contexte de cellules T CD8 anti-VIH robustes. Allèles Ces résultats ouvrent de nouvelles voies pour la conception de stratégies de guérison fonctionnelles visant à réduire les réservoirs du VIH en renforçant la réponse immunitaire pour protéger ces lymphocytes T CD4 à mémoire centrale.

Remarques

Remerciements Nous remercions tous les cliniciens et patients qui ont participé à la cohorte ALT ANRS CO15 et au groupe d’étude ALT ANRS CO15 Henri Agut, Jean-Pierre Clauvel, Dominique Costagliola, Maciel-Bosco DaSilva, Patrice Debré, Didier Sicard et Jean-Paul Viard Nous remercions le Dr Prazuck, le Dr Hocqueloux et les patients de l’Hôpital d’Orléans pour avoir fourni des échantillons sanguins afin de développer les tests. Nous remercions également le Docteur V Maino BD Biosciences de fournir des anticorps anti-CCR5 conjugués à PE. soutien Enfin, nous remercions les Docteurs Antonio Freitas, Laura Papagno et Darragh Duffy pour les discussions utiles et Jo Ann Cahn pour l’aide à la préparation des manuscrits. Soutien financier Ce travail a été soutenu par l’ANRS et par l’Institut National de Santé et de la Recherche MédicaleConflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le Formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels d’intérêt Les conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués