Ligands bivalents pour le récepteur de la sérotonine 5-HT3

Le récepteur de la sérotonine 5-HT3 (5-HT3R) appartient à la famille des canaux ioniques ligand-dépendants (LGIC) et montre une structure pentamérique similaire à celle de l’acétylcholine nicotinique (nACh), de la glycine, et des récepteurs de l’acide aminé-aminobutyrique de type A (GABAA) .1b En vertu de son architecture multimérique, 5-HT3R représente un exemple intrigant de récepteurs biologiques intrinsèquement multivalents. Initialement, une seule sous-unité 5-HT3R (5-HT3A) a été clonée, et par la suite, d’autres sous-unités 5-HT3R (5-HT3B-5-HT3E) ont été identifiées.1,1b L’ADNc 5-HT3A forme une surface cellulaire homopentamérique fonctionnelle récepteurs, tandis que 5-HT3B a été rapporté pour former 5-HT3Rs fonctionnels lorsqu’il est exprimé avec 5-HT3A mais pas lorsqu’il est exprimé seul.1,1b La structure tridimensionnelle de 5-HT3R n’a pas encore été déterminée à un niveau atomique, mais une grande quantité d’expériences de mutagenèse dirigée a été réalisée pour recueillir des informations sur la structure et la fonction, et les données obtenues ont été utilisées dans la construction de modèles d’homologie des récepteurs 3D.3 L’activité de recherche effectuée par les sociétés pharmaceutiques dans le développement d’antagonistes de 5-HT3R a produit un grand nombre de molécules de médicament présentant une efficacité remarquable dans la prévention des nausées et des vomissements induits par une chimiothérapie aiguë. Notre intérêt pour le développement des ligands 5-HT3R a commencé à partir de l’étude des dérivés de l’arylpipérazine liés à la quipazine (schéma 1) et a depuis produit une quantité considérable d’informations sur l’interaction de cette classe de ligands avec leur récepteur.4,4bScheme 1Development of Dans un article précédent, nous avons décrit à la fois les résultats de l’exploration de la poche réceptrice interagissant avec le bord C (positions 3 et 4) du noyau quipazine quinoline au moyen d’un approche systématique basée sur des sondes lipophiles (principalement des chaînes alkyles de longueurs différentes dans les composés 34DSQ) et le développement du ligand hétérobivalent apparenté à la tacrine 1. Ce composé a montré une puissance nanomolaire pour 5-HT3R et pour l’AChE humaine et représentait le premier exemple de ligand de 5-HT3R de haute affinité présentant une activité inhibitrice de l’AChE nanomolaire5. Plus récemment, nous avons rapporté une approche non covalente de complexes multivalents compo sed d’une urée hydrophobe fonctionnalisée adamantyl-fonctionnalisée, de la poly (propylène imine) dendrimère, d’une molécule invariante à base d’oligo (éthylène glycol) et d’un ligand arylpiperazine hétérobivalent 5-HT3R (2a, b) .6 Ce travail a fourni de nouvelles perspectives et des complexes non covalents ajustables avec un potentiel pharmacologique. Cependant, la stabilité des complexes supramoléculaires dans l’environnement biologique devrait être encore augmentée pour permettre l’évaluation in vivo de la construction. Ainsi, l’exploration de la multivalence dans la fonction 5-HT3R au moyen de constructions supramoléculaires implique la préparation de nouvelles molécules hôtes montrant une force d’interaction accrue avec l’hôte. La conception rationnelle de ligands bivalents adaptés nécessite une compréhension profonde de leur interaction avec le récepteur. Par conséquent, dans le présent article, nous rapportons les résultats d’une étude axée sur la caractérisation de l’interaction du 5-HT3R avec des ligands bivalents assemblés par (a) un ligand arylpiperazine 5-HT3R optimisé (jouant le rôle d’ancre dans interagissant avec le site de liaison principal du 5-HT3R), (b) un espaceur présentant une longueur différente, et (c) une sonde montrant différentes caractéristiques stéréoélectroniques et fonctionnelles. Sur la base de leurs caractéristiques fonctionnelles, les sondes peuvent être classées en chimioconcentration [par exemple, la fraction d’acide uréidoacétique (UAA) des hôtes hétérobivalents 2a, b] ou biofonctionnel [un groupe capable d’interagir avec des récepteurs ou des enzymes, par exemple, tacrine dans ligand hétérobivalent 1, ou la même ancre arylpiperazine (MPQC) dans les ligands homobivalents correspondants] (Figure 11). Figure 1Design des ligands bivalents arylpiperazine 3 – 5. Les éléments en rouge sont les groupes pharmacophoriques, qui permettre à la partie arylpipérazine (ancre) d’interagir avec le site de liaison 5-HT3R, magenta indique la sonde responsable de l’interaction … Les ligands homobivalents 3a – f ont été synthétisés comme décrit dans le schéma 2, tandis que la synthèse de la cible restante Les composés clés du tableau 1 sont décrits dans les renseignements à l’appui: Les intermédiaires clés 9a et # 02013; f ont été obtenus à partir du chlorure d’acyle 7 (5) suivant deux voies différentes. On a fait réagir 7 avec la diamine appropriée pour obtenir des homodimères chlorés 9a, tandis que des homodimères plus longs ont été obtenus à partir des amides 8e, f par déprotection et couplage avec 7. La substitution nucléophile avec N-méthylpipérazine a complété la séquence réactionnelle pour cibler les homodimères 3a – f.Schéma 2: synthèse des ligands homobivalents 3a et # x02013; affinité de liaison 15-HT3R des ligands bivalents 3 et des ligands monovalents de référence 6 L’affinité des composés 3 et 5 pour le 5-HT3R a été mesurée au moyen d’études de déplacement effectuées avec granisetron radiomarqué spécifiquement lié au 5-HT3R dans les membranes corticales de rat7 (voir les Informations de Support), et les résultats sont résumés dans le Tableau 1. Les résultats suggèrent que le 5-HT3R est capable de recevoir des ligands bivalents montrant différents espaceurs et sondes, moduler l’affinité d’une manière significative. Les ligands homobivalents 3 sont les ligands bivalents les plus puissants dans chaque sous-groupe caractérisés par le même espaceur, et plus particulièrement, ils sont plus puissants que les ligands monovalents de référence correspondants 6a – f portant une sonde t-butoxycarbonylamino. De plus, les caractéristiques de l’espaceur semblent affecter l’interaction des différentes sondes. Ainsi, l’attache heptaméthylène semble se comporter comme l’espaceur optimal (voir les valeurs RP dans le tableau 1), et soit son raccourcissement à l’hexaméthylène, soit l’allongement à ses équivalents octaméthylène diminue l’affinité de 5-HT3R d’environ 1 ordre de grandeur dans les composés 3. et 4. Le remplacement de deux unités méthylène dans les espaceurs octaméthylène du ligand homobivalent 3c par deux atomes d’oxygène comme dans 3d produit une augmentation de puissance d’environ 1 ordre de grandeur, alors que l’allongement de l’espaceur conduisant à 3e, f génère une subtile modulation d’affinité. . Lorsque de longs espaceurs sont considérés, une fluctuation possible de l’environnement aqueux extrareceptorial peut être supposée, mais les relations d’affinité de structure dans les composés 3e, f portant les espaceurs les plus longs (23 ou 29 équivalents de méthylène, respectivement) semblent suggérer que le La sonde pourrait interagir avec différents environnements. Le modèle d’homologie du 5-HT3AR homomère décrit dans un article précédent3 a été utilisé comme un instrument pour vérifier la capacité du récepteur à accueillir des ligands bivalents. Les structures protonées de ligands homobivalents avec des espaceurs de longueur différente (3a – d, voir le tableau 1) ont été ancrées dans l’interface du dimère 5-HT3A-A. Dans tous les cas, les principales positions du fragment d’ancrage du ligand se trouvent dans le site de liaison de la sérotonine et partagent des caractéristiques similaires: La tête chargée du fragment pipérazine établit une interaction de liaison H renforcée avec la chaîne latérale Glu129, l’amide proche NH est lié à l’hydrogène à la chaîne latérale hydroxyle de Tyr153, et la fraction aromatique ligand établit des interactions avec Trp183 et Trp90.8 et 912. Au contraire, les poses d’arrimage de la sonde d’arylpipérazine peuvent être regroupées en deux groupes principaux . Le premier site de liaison putatif pour la sonde est situé en dessous du site actif connu, à proximité de la membrane (figure ​ (figure2d), 2d), et est caractérisé par des résidus aromatiques et polaires: Tyr73, Tyr88 et Phe130, ce dernier s’est révélé être un résidu clé pour la fonction du récepteur, 10 et Ser177, qui établissent une interaction H-liaison avec l’anneau pipérazinique.Figure 2Docking des composés 3a – c dans le dimère du récepteur 5-HT3A-A: mode de liaison de la sonde à la manière d’une pince (a), sur la surface du récepteur (b), dans la région extracellulaire supérieure (c) et à proximité de la membrane (d). Le second site de liaison putatif a été trouvé dans la partie supérieure. région extracellulaire de l’interface dimère (dans la direction opposée par rapport à la membrane, figure 2c) 2c) et est caractérisée par Asp189, qui forme une liaison H renforcée de charge avec la tête chargée de la fraction pipérazine, et des résidus polaires et aromatiques, tels que Tyr143 et Gln151, dont le rôle dans le bac antagoniste ding, en particulier le granisétron, a déjà été prouvé par des expériences de mutagénèse en un seul point.8b, 11,12 Bien que tous les ligands homobivalents étudiés puissent s’ancrer dans ces deux poches de liaison putatives, ils présentent des particularités de liaison dignes de mention. Le ligand espaceur heptaméthylène (3b), dans ses poses de basse énergie les plus fréquentes, montre un espaceur étiré, et sa sonde se trouve dans l’une des deux poches putatives de liaison de sonde (Figure ​ .2c, d). Ces poses peuvent indiquer la présence d’un site de liaison secondaire ou allostérique, comme indiqué précédemment par Barbosa et al., 3 ce qui pourrait expliquer la plus grande affinité de ce ligand homobivalent pour le 5-HT3R. Au contraire, le ligand homobivalent avec l’espaceur hexaméthylène le plus court (3a) préfère la pose d’amarrage où les deux amines cationiques des moitiés de pipérazine interagissent avec Glu129 à la manière d’une pince (Figure 2a), tandis que le ligand avec l’espaceur octaméthylène plus long (3c) préfère une pose où la sonde s’étend à l’extérieur de la surface du récepteur (figure ​ (figure 2b) .2b).La simulation dynamique moléculaire réalisée sur cette dernière pose de 3c montre que la sonde se déplace progressivement de l’interface du récepteur vers une surface polaire proche de la boucle C provoquant un déploiement partiel de la boucle (principalement dû à la formation de liaisons H persistantes entre les sonde et les chaînes latérales de Ser227 et Glu225 sur la surface du récepteur). Cela pourrait être responsable de l’erreur de déplacement du fragment d’ancrage, qui s’éloigne de Glu129 (un résidu clé pour la liaison agoniste / antagoniste), empêchant la formation de l’interaction H-liaison renforcée renforcée, expliquant ainsi l’affinité inférieure du composé 3c, qui est 25 fois moins active que 3b. Enfin, il convient de noter que les poses d’accostage du ligand homobivalent 3d sont différentes de celles de 3c, qui est caractérisée par la même longueur d’espacement en équivalents méthylène. Dans les groupes de basse énergie les plus peuplés, l’orientation du composé 3d est très similaire à celle du ligand espaceur heptaméthylène (3b); par conséquent, la sonde ne s’étend pas à l’extérieur de la surface du récepteur mais se trouve dans l’une des deux poches de liaison de la sonde putative (Figures ​ (Figures 2c, d) .2c, d). En effet, le remplacement de deux motifs méthylène dans les espaceurs octaméthylène de l’homodimère 3c par deux atomes d’oxygène dans l’homodimère 3d stabilise le complexe en favorisant les interactions entre les atomes d’oxygène dans l’espaceur et les résidus d’interface. Ces résultats pourraient justifier l’augmentation significative de la puissance (environ 1 ordre de grandeur) du ligand homobivalent 3d par rapport au composé 3c.Les résultats des simulations de dynamique moléculaire suggèrent la possibilité que la sonde de ligands homobivalents avec des espaceurs plus longs (par ex. ou 29 équivalents méthylène) atteint d’autres sites de liaison dans le même récepteur. Pour vérifier cette hypothèse, le composé avec l’espaceur le plus long (3f, voir le tableau 1) a été amarré manuellement dans le dimère 5-HT3R: Bien que l’espaceur ait été forcé d’adopter une conformation complètement étendue irréaliste, la sonde n’a pas pu atteindre la liaison adjacente interface. Cependant, la sonde de ces ligands bivalents longs peut soit intercepter les sites actifs d’autres récepteurs, soit s’ancrer dans d’autres poches de liaison probables sur la même surface réceptrice. Dans la tentative de découvrir de nouveaux sites de liaison possibles, l’amarrage rigide de la sonde a été effectué surface du récepteur. Les résultats ont montré la présence de trois surfaces principales capables de recevoir la sonde d’arylpipérazine (Figure 33). Figure 3DCockage de la sonde d’arylpipérazine sur la surface du récepteur 5-HT3A: surface chargée des sites putatifs dans le récepteur extracellulaire partie (a), au-dessus de la boucle C (b), et près de la membrane (c) .La pose principale de la sonde se trouve dans la partie extracellulaire du récepteur, près de l’entrée du canal, à l’opposé de la membrane x200B; (Figure3a) .3a) Ici, la sonde occupe une poche qui présente des caractéristiques très similaires à celles du site sérotoninergique.En fait, les résidus principaux impliqués dans la liaison du ligand sont aromatiques ou chargés négativement: Asn49 (dont le groupe carboxylique est Glu98 (dont la chaîne latérale forme une interaction H-liaison avec le ligand amino group), Tyr50, Phe99 et Trp102 (qui stabilisent le complexe interagissant avec le groupe aromatique). deuxième site de surface putatif sho ws différentes caractéristiques. Il s’agit d’une poche polaire (Pro63, Ile187, Asn191 et Gln188) entourée de quelques résidus positivement chargés: Arg 61, Arg196 (dont le groupe guanine est lié par l’hydrogène à la tête cationique du cycle pipérazine), et Lys62 (qui forme une liaison H avec le groupe ligand carbonyle, figure ​ figure3b) .3b). Ce site secondaire est localisé dans une région de surface juste au-dessus de la boucle C, très proche du site actif; par conséquent, il peut être exploité par des ligands bivalents avec un espaceur relativement court, comme dans le cas du composé 3c discuté ci-dessus. De plus, comme ce site est chargé positivement, il peut facilement contenir des sondes chimio-fonctionnelles négatives, telles que la fraction uréidoacétique déprotonée des composés 5e, f. Enfin, la pose la moins importante montre la sonde ligand située dans une poche de surface à proximité de la membrane formée par Ile242, Asn175, Asp172, Val173, Tyr167 et Gln174 (Figure 3c) .3c). Par conséquent, en fonction de la longueur de l’espaceur, une sonde ligand bivalente peut interagir avec l’un des sites putatifs sur la surface ou atteindre d’autres récepteurs et agir comme un ligand biofonctionnel ou chimio-fonctionnel sur la base de ses caractéristiques stéréoélectroniques et fonctionnelles. des interactions du 5-HT3R avec des ligands arylpipérazine a conduit à concevoir une approche de conception de ligands bivalents dans laquelle une fraction arylpipérazine est liée au moyen d’un espaceur à une sonde présentant différentes caractéristiques fonctionnelles (chimioconcentration ou biofonctionnelles).L’affinité élevée de 5-HT3R montrée par les ligands homobivalents et hétérobivalents prouve la viabilité de notre approche, qui peut être considérée d’une large applicabilité dans la conception de ligands bivalents adaptés à des applications spécifiques. De plus, l’existence sur la surface du récepteur de trois sites de liaison accessoires potentiels pour la fraction arylpipérazine montrée par les études de modélisation moléculaire implique que la multivalence dans 5-HT3R pourrait impliquer des domaines récepteurs différents du site de liaison principal. La forte affinité montrée par les ligands homobivalents 3a – f suggère que la bivalence est une approche prometteuse dans la modulation 5-HT3R. Puisque la bivalence peut être considérée comme la première étape de la multivalence, les résultats obtenus fournissent la base rationnelle pour l’application des concepts de multivalence à l’étude de la fonction 5-HT3R.