Une étude observationnelle en laboratoire sur les épidémies de coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient à Djeddah et Riyad, Royaume d’Arabie Saoudite,

Contexte Au printemps, une augmentation soudaine du nombre d’infections au MERS-CoV signalées par le syndrome respiratoire du Moyen-Orient au Moyen-Orient a été observée en Arabie Saoudite, avec des hypothèses de Jeddah pour expliquer la surveillance accrue, l’augmentation de la transmission zoonotique, la transmission nosocomiale et Les résultats du diagnostic du laboratoire régional de Jeddah ont été analysés Les virus de l’épidémie de Jeddah et les virus survenant au même moment à Riyad, Al-Kharj et Madinah ont été séquencés en totalité ou en partie. Un ensemble de polymorphismes mononucléotidiques Les virus de Riyad et de Jeddah ont été isolés et étudiés en culture cellulaire. Résultats Jusqu’à des échantillons ont été reçus par jour pour la transcription inverse Réaction en chaîne par polymérase Test de RT-PCR Une évaluation de compétence de laboratoire a suggéré des résultats positifs et négatifs r 47% des échantillons positifs lors de l’épidémie de Jeddah provenaient de l’hôpital King Fahd Tous les virus de Djeddah étaient monophylétiques et similaires, tandis que les virus de Riyad étaient paraphylétiques et divers. découvert à Riyad. Un virus de type Djeddah a été trouvé à Riyad, avec des antécédents de voyage correspondants aux isolats du virus de Jeddah représentant des foyers à Jeddah et Riyad n’étaient pas différents de MERS-CoV EMC / en réplication, échappement de la réponse interféron, ou neutralisation du sérumConclusions L’excrétion du virus et les fonctions virales n’ont pas changé de manière significative au cours de l’épidémie à Djeddah. Ces résultats suggèrent que les épidémies ont été causées par des virus biologiquement inchangés liés à la transmission nosocomiale

MERS-coronavirus, épidémie, transmission nosocomiale, isolement du virus, contrôle de l’infection de transmissionVoir le commentaire éditorial de Leitmeyer sur les pages -Le syndrome respiratoire du Moyen-Orient coronavirus MERS-CoV a été découvert dans des cas sporadiques et de petits cas de graves maladie respiratoire aiguë Tous les cas sont survenus dans la péninsule arabique ou avaient des liens épidémiologiques avec la région Le nombre total de cas notifiés depuis mars De fin mars à avril, une augmentation exponentielle des nouveaux cas est survenue en Arabie Saoudite Les hypothèses pour expliquer le type d’épidémie comprennent une surveillance accrue, une augmentation de la transmission zoonotique, une augmentation de la transmission nosocomiale et des changements dans la transmissibilité virale, ainsi que des résultats faussement positifs dus à: erreurs de laboratoire Cette dernière option a suscité des inquiétudes quant à la validité Compte tenu de l’ampleur de l’épidémie à Djeddah, il sera nécessaire de reconstruire les chaînes de transmission et de disséquer l’épidémiologie de telle sorte que des paramètres épidémiologiques fondamentaux puissent être déduits. Les études virologiques peuvent fournir des indications précieuses sur la virulence et la transmissibilité même en l’absence d’informations cliniques ou épidémiologiques détaillées. En outre, l’évolution du nombre et de la nature des demandes Dans l’épidémie de Djeddah, tous les tests de RT-PCR en chaîne par polymérase avec transcription inverse ont été réalisés de manière centralisée par le laboratoire régional de Jeddah. JRL JRL est un laboratoire de référence au sein du laboratoire. rk du Ministère saoudien de la Santé qui dessert la région de Djeddah et fournit des tests de confirmation MERS-CoV pour tous les laboratoires du Ministère de la Santé du Royaume d’Arabie Saoudite. Nous fournissons un aperçu direct des résultats de laboratoire de JRL et effectuons une analyse approfondie de l’épidémie. virus associé à des études fonctionnelles de la virulence et de l’évasion immunitaire en culture cellulaire Nous comparons les virus dérivés de Djeddah avec des virus survenus ailleurs au pays au cours de la même période

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

RT-PCR et séquençage

Toutes les procédures ont suivi les protocoles décrits précédemment JRL a utilisé des kits LightMix Tib-Molbiol contenant des amorces prémélangées et une sonde pour les tests upE et ORFA afin de minimiser le risque de contamination et de détection des réactifs Des amorces pour le séquençage du génome viral sont disponibles sur demande

Isolement de virus

Des échantillons ont été inoculés dans des cellules VeroB ensemencées à des cellules x / mL dans des plaques -well heures avant l’infection, pendant une heure à ° C. Les cellules ont été incubées à ° C et vérifiées tous les jours pour des effets cytopathogènes. RT-PCR pour l’augmentation de l’ARN viral spécifique au MERS-CoV PCR Les puits positifs à la PCR ont été récoltés et utilisés pour la production de stocks de virus Les stocks de virus ont été quantifiés par titrage sur plaque de cellules VeroB comme décrit précédemment

Cinétique de croissance virale

A cellules ATCC CCL- ont été ensemencées à des cellules / puits dans des plaques bien-heures avant l’infection Au, et, et heures après l’infection, les surnageants ont été échantillonnés, et l’augmentation de l’ARN viral spécifique au MERS-CoV a été quantifiée en temps réel. RT-PCR

Titrage de plaque et dosage de neutralisation

Les cellules VeroB ont été ensemencées à des cellules x / puits dans des plaques bien avant le titrage. Les cellules ont été recouvertes après l’infection avec du micropolymère d’Avicel FCM à une concentration finale de% dans le milieu d’Eagle modifié par Dulbecco. et colorées avec une solution de cristal violet Pour le dosage de neutralisation , des unités formant plaque de MERS-CoV ont été préincubées avec du sérum dilué pendant une heure à ° C.

RÉSULTATS

Performance du laboratoire et résultats diagnostiques globaux

L’identification des cas et la notification pendant l’épidémie à Jeddah étaient principalement basées sur des tests en laboratoire. Pour obtenir un aperçu des tests de laboratoire pendant l’épidémie, la liste de réception des échantillons dans JRL a été analysée. échantillons de Jeddah Figure A De Janvier à Avril, JRL a reçu des échantillons pour des tests RT-PCR pour MERS-CoV De ces échantillons, ont été reçus depuis Mars, date à laquelle le premier cas de l’épidémie de Djeddah a été testé. la charge de travail mensuelle en avril Le nombre maximal d’échantillons reçus en une journée a été près de la moitié de tous les échantillons positifs lors de l’épidémie de Jeddah provenant de l’hôpital King Fahd KFH Le taux d’échantillons positifs avec KFH semblait augmenter plus tôt que dans les autres les hôpitaux de la ville Figure B Au cours des semaines d’avril, la fraction de RT-PCR positive conduit également à des échantillons de Djeddah Comme les échantillons de toutes les villes ne variaient pas significativement Tableau supplémentaire Bien que la liste d’entrée du laboratoire n’identifiait pas l’état des symptômes des patients, elle indiquait par la présence d’un code d’identification du patient si les cas étaient hospitalisés ou faisaient vraisemblablement partie d’une enquête de contact. On s’attendait à ce que la proportion d’échantillons ayant de faibles charges virales indiquée par des valeurs de seuil de cycle élevé soit élevée dans les enquêtes de contact. Figure C et D Les études de fiabilité des procédures de laboratoire n’ont révélé aucune preuve de contamination de fond générique dans le laboratoire Données supplémentaires

Tests de table dans les échantillons avec et sans numéro hospitalier, par ville Tests avec nombre de tests hospitaliers sans ratio hospitalier Nombre Jeddah% positif% positif% Autre que Jeddah% positifs positifs% Tests urbains avec nombre de tests hospitaliers sans hospitalisation Numbera Ratio Jeddah% positif% positif % Autre que Djeddah% de positifs positifs% a Ces cas ont été enrôlés sans numéro hospitalier mais portaient l’identifiant « Contact » ou « HCW » [travailleur de la santé] ou avaient un numéro de portable entré dans le champ identifiant que le laboratoire devait appeler en cas de tests diagnostiques auto-initiés par les médecins ou les membres de leur famille n = View Large

Figure Vue largeTélécharger la diapositive Résumé des caractéristiques de l’épidémie dérivées des données du fichier A du laboratoire régional de Jeddah A, demandes de diagnostic globales B, cas positifs et axe = cas par jour à l’hôpital King Fahd KFH par rapport à tous les autres hôpitaux. fin avril C et D, Distribution des valeurs Ct seuil du cycle dans les échantillons relatifs aux investigations dans les cas à Jeddah sans numéro hospitalier n = échantillons positifs vs échantillons avec numéro hospitalier n = échantillons positifs Les valeurs moyennes de Ct dans les cas et les contacts étaient et, respectivement – test t à queue, P & lt; Figure Vue largeTélécharger la diapositive Résumé des caractéristiques de l’épidémie dérivées des données du fichier A du laboratoire régional de Jeddah A, demandes de diagnostic globales B, cas positifs et axe = cas par jour à l’hôpital King Fahd KFH par rapport à tous les autres hôpitaux. fin avril C et D, Distribution des valeurs Ct seuil du cycle dans les échantillons relatifs aux investigations dans les cas à Jeddah sans numéro hospitalier n = échantillons positifs vs échantillons avec numéro hospitalier n = échantillons positifs Les valeurs moyennes de Ct dans les cas et les contacts étaient et, respectivement – test t à queue, P & lt;

Séquence génomique virale et phylogénie

Sept des virus de l’épidémie de Jeddah ont été entièrement séquencés et comparés avec les séquences du génome entier ou subtotal disponibles en avril dans GenBank Tableau supplémentaire Une analyse des principaux cadres de lecture à travers le génome, en tenant compte des séquences de gènes spike supplémentaires KM-KM, changements d’acides aminés dans les domaines protéiques pertinents Données supplémentaires Tous les virus appartenant à l’épidémie de Jeddah regroupés en clade phylogénétique Figure

Figure Vue largeDispositif Phylogénétique inféré en utilisant MrBayes pour les régions codantes concomitantes des génomes de coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient ou des génomes partiels échantillonnés chez l’homme et les chameaux Nous avons utilisé un modèle de substitution GTR réversible Affiché est le consensus majoritaire des arbres échantillonnés à partir de la distribution postérieure avec des longueurs de branches moyennes. Le support postérieur est montré pour les nœuds où & lt; Les séquences échantillonnées à partir de chameaux sont notées avec un cercle jaune, celles des humains avec un cercle vert. Les séquences nouvelles de cette étude sont indiquées en gras. Le groupe comprenant des virus isolés des hôpitaux de Djeddah / Makkah en avril est surligné d’une boîte rouge. La ville médicale du prince Sultan, Riyad, en mars-avril est surlignée en bleu A titre de comparaison, l’épidémie de l’hôpital Al-Hasa est surlignée en jaune et la flambée de la communauté Hafr-Al-Batin en vert. MrBayes pour les régions codantes concaténées des génomes de coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient ou des génomes partiels prélevés chez l’homme et les chameaux. Nous avons utilisé un modèle de substitution GTR réversible en fonction du temps des codons. échantillonné à partir de la distribution postérieure avec des longueurs de branche moyennes Le support postérieur est représenté pour les nœuds où & lt; Les séquences échantillonnées à partir de chameaux sont notées avec un cercle jaune, celles des humains avec un cercle vert. Les séquences nouvelles de cette étude sont indiquées en gras. Le groupe comprenant des virus isolés des hôpitaux de Djeddah / Makkah en avril est surligné d’une boîte rouge. La ville médicale du prince Sultan, Riyad, en mars-avril est surlignée en bleu A titre de comparaison, l’épidémie de l’hôpital Al-Hasa est surlignée en jaune et l’éclosion de la communauté Hafr-Al-Batin en vert. échantillons obtenus à Riyad, Al-Kharj et Madinah en mars et avril pour comparaison. Ces séquences partielles comprenaient l’ensemble des gènes protéiques structurels des génomes MERS-CoV, d’environ kb de longueur. Comme le montre la figure, les virus de Riyad tombaient dans différentes positions, dont le clade peut constituer une grappe de transmission d’homme à homme, à laquelle aussi les cas exportés vers l’Indiana aux États-Unis ainsi que les Pays-Bas bel Un autre virus de Riyad groupé avec des virus de type Djeddah Ce patient est originaire de Jeddah et a rendu visite à son fils malade à KFH à Djeddah avant son voyage à Riyad. Pour mieux évaluer la diversité des virus circulant à Jeddah, les polymorphismes mononucléotidiques Les SNP ont été étudiés. Tableau Tous les échantillons sauf la même combinaison de SNP L’échantillon déviant a été prélevé en avril et avait un double pic dans le SNP qui a été confirmé deux fois par répétition de RT-PCR et séquençage. Les séquences d’un patient américain et d’un patient à Riyad avec des antécédents de voyage connus à Jeddah présentaient des profils SNP typiques de Jeddah Tableau En revanche, les virus détectés à Djeddah mois et mois avant que l’épidémie ne se groupait avec les virus de l’épidémie de type Jeddah Un virus détecté à Riy adh SA_ était apparenté à des virus camel partageant un ancêtre commun récent avec des virus d’épidémie de type Jeddah, mais était distinct dans son profil SNP

Tableau Polymorphismes à un seul nucléotide dans les virus de type Jeddah et les virus de référence ID de l’échantillon Echantillon / origine du patient Date d’échantillonnage Position SNP dans les échantillons EMC / Génome de JRLa Jeddah, Makkah Mar- Apr C T G A Humain